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结直肠癌p53和DNA损伤调节基因1的表达及临床意义

2024-04-10 109 上传者：管理员

摘要：目的分析p53和DNA损伤调节基因1(p53 and DNA damage regulated gene 1,PDRG1)在结直肠癌中的表达及其临床意义。方法检索癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中结直肠癌数据集，比较PDRG1 mRNA在结直肠癌组织和正常结直肠组织中的表达差异，分析其表达与临床病理特征及预后的关系。DNA甲基化交互可视化数据库（DNA methylation interactive visualization database,DNMIVD）分析PDRG1基因甲基化与m RNA表达水平的关系。另选取本院2019年2月至2020年5月存档的102例结直肠癌组织及其癌旁正常结直肠组织石蜡标本进行验证，采用免疫组织化学法检测PDRG1蛋白的表达。结果 TCGA数据库分析发现，PDRG1 mRNA在结直肠癌组织（n=284）中的表达较正常结直肠组织（n=41）增高（P<0.01），且结直肠癌PDRG1 mRNA表达与拷贝数变异呈正相关（n=273;r=0.792,P<0.01）。DNMIVD分析显示，PDRG1启动子甲基化β值与基因表达水平呈负相关（r=-0.34,P<0.01）。TCGA数据库分析显示，结直肠癌患者（n=273）PDRG1 mRNA表达在肿瘤位置、TNM分期及远处转移方面比较，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；对245例结直肠癌患者进行Kaplan-Meier生存分析发现，PDRG1 mRNA高表达患者（以中位数为分界值，大于中位数为高表达）无瘤生存期较短（P=0.019）。免疫组织化学检测显示，结直肠癌组织中PDRG1蛋白表达阳性率高于正常结直肠癌组织[87.3%(89/102) vs32.4%(33/102),P<0.01]。结论 PDRG1在结直肠癌中高表达，且与肿瘤位置、远处转移和无瘤生存期有关，可能成为结直肠癌潜在的生物标志物。

关键词：
p53和DNA损伤调节基因1
标志物
甲基化
癌症基因组图谱
结直肠癌
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结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一。2020年全球结直肠癌新发病例及死亡病例分别占所有恶性肿瘤的第3位和第2位[1,2]。结直肠癌的发生与发展是多因素、多阶段和多基因共同作用的结果。许多生化分子标志物参与结直肠癌的发生和发展，可用于结直肠癌的早期筛查[3,4]。本研究组先前研究发现，结直肠癌组织中miR-214表达下调；miR-214抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡[5,6]。结合既往研究及TargetScan软件靶基因预测结果，p53和DNA损伤调节基因1(p53 and DNA damage regulated gene 1,PDRG1）是miR-214的潜在靶基因[7]。本文以PDRG1为靶点，采用生物信息学方法探索PDRG1在结直肠癌中的表达，并分析其与结直肠癌临床病理特征及生存期的关系，评估PDRG1在结直肠癌发展中的作用，为结直肠癌的治疗及预后寻找潜在的分子标志物。

1、资料与方法

1.1 一般资料

2021年12月通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库下载并预处理结直肠癌数据集的mRNA Seq V2数据，进行PDRG1相对表达量的分析。同时下载临床资料和预后数据。筛选得到含有PDRG1 mRNA表达量资料的结直肠癌组织样本284例（年龄31～90岁，中位年龄66岁；男性153例，女性131例）及正常结直肠组织样本41例（年龄40～90岁，中位年龄73岁；女性21例，男性20例）。

另选取本院2019年2月至2020年5月存档的102例结直肠癌组织及其癌旁正常组织进行免疫组织化学染色。其中男性60例，女性42例；年龄40～87岁，中位年龄69岁。所有患者均为首次行结直肠癌手术，术后病理证实为结直肠癌。本研究通过大连大学附属新华医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及抗体

鼠抗人PDRG1单克隆抗体购自美国Origene公司，通用型血清淀粉样蛋白P(serum amyloid P,SAP）二抗、柠檬酸-EDTA抗原修复液、PBS缓冲液和DAB显色试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.3 TCGA数据分析

对PDRG1表达量进行正态性检验，分析结直肠癌组织和正常结直肠组织中PDRG1 mRNA表达差异。选取TCGA数据集中临床参数和生存资料完整的病例，根据表达谱数据对样本的PDRG1表达进行排序，以中位数为分界值，将结直肠癌组织PDRG1表达量分为高表达组和低表达组，分析PDRG1表达水平与临床病理特征的关系。KaplanMeier法绘制总生存和无瘤生存曲线，分析PDRG1表达量与患者预后的关系。

1.4 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学生物素法检测PDRG1蛋白的表达，操作步骤严格按照二步法免疫组织化学试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）说明书进行。切片置于柠檬酸抗原修复液高压修复，过氧化氢酶处理10 min，山羊血清封闭30 min，一抗（工作浓度1∶200)4℃孵育过夜。PDRG1阳性定位于细胞膜和细胞质，显色呈淡黄色至棕褐色。免疫组织化学结果判读由2位病理科医师在双盲情况下完成。高倍镜下随机选取5个区域，分别计算阳性细胞百分率及染色强度，取平均值。细胞染色强度：0分阴性（无染色）；1分弱阳性（淡黄色）；2分阳性（深黄色）；3分强阳性（棕褐色）。阳性细胞百分比：0分（<10%);1分（10%～25%);2分（26%～50%);3分（5l%～75%);4分（>75%）。以二者评分乘积得分判断结果：0～1分为阴性，2～4分为+，5～8分为++，9～12分为+++，以+～+++为阳性。

1.5 DNA甲基化交互可视化数据库（DNA methylation interactive visualization database,DNMIVD）数据分析

2023年9月3日下载DNMIVD中关于PDRG1基因的甲基化数据，分析结肠癌中PDRG1基因甲基化与PDRG1 mRNA表达水平的关联，计算Spearman相关系数及P值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计数资料以频数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本或配对样本t检验。采用Spearman法进行相关性分析。Kaplan-Meier法分析PDRG1表达量与患者预后的关系。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 结直肠癌及正常结直肠组织中PDRG1 mRNA的表达

TCGA数据库收集284例结直肠癌组织及41例正常结直肠组织的PDRG1 mRNA表达信息。获取其中配对的结直肠癌及其癌旁正常组织24例。在所有样本中，结直肠癌组织中PDRG1 mRNA表达较正常结直肠组织增高（t=144.96,P<0.01；图1A）。在配对的24例样本中，91.7%(22/24）的结直肠癌癌组织中PDRG1 mRNA表达高于正常结直肠组织[（67.35±9.68) vs (49.58±4.91),P<0.01；图1B]。

2.2 结直肠癌组织中PDRG1蛋白的表达

为进一步验证PDRG1在结直肠癌中的表达，采用免疫组织化学法检测结直肠癌及癌旁正常结直肠组织中PDRG1蛋白的表达。PDRG1蛋白阳性染色主要定位于细胞质中，呈棕黄色或棕褐色（图2）。结直肠癌组织中PDRG1的阳性率为87.3%(89/102），高于癌旁正常结直肠组织的32.4%(33/102），差异具有统计学意义（χ2=63.949,P<0.01）。

2.3 PDRG1 mRNA表达与结直肠癌临床病理特征的关系

TCGA数据集筛选后共纳入273例临床病理参数完整的结直肠癌患者资料，其中男性150例，女性123例；年龄31～90岁，平均年龄65岁；男性平均年龄64岁，女性平均年龄65岁。结直肠癌组织中PDRG1 mRNA表达符合正态分布，均数为65.927，中位数为65.525。PDRG1 mRNA表达量以中位数为分界值，分为高表达组（≥65.525,n=141）与低表达组（<65.525,n=132），对该数据集中结直肠癌患者预后影响因素进行赋值。结果显示，PDRG1 mRNA表达水平在肿瘤位置、TNM分期和肿瘤远处转移方面比较，差异均具有统计学意义（均P<0.05），而在年龄、性别和淋巴结转移方面比较，差异均无统计学意义（均P>0.05，表1）。

图1 TCGA数据库分析结直肠癌及正常结直肠组织中PDRG1 mRNA的表达

图2 免疫组织化学染色检测结直肠癌组织和癌旁正常组织中PDRG1蛋白表达（SP×100)

2.4 结直肠癌组织中PDRG1 mRNA高表达与拷贝数增加的关系

TCGA数据库下载结直肠癌组织中有拷贝数变异（copy number variation,CNV）数据的616例病例。选取其中同时有PDRG1 mRNA表达数据且有具体临床信息的病例273例，其中男性150例，女性123例；年龄31～90岁，平均年龄65岁，中位年龄66岁。分析二者相关性显示，PDRG1 mRNA表达与CNV呈正相关（r=0.792,P<0.01；图3）。

表1 TCGA数据集中273例结直肠癌患者PDRG1 mRNA表达与临床病理特征的关系（例，%）

2.5 PDRG1表达与结直肠癌预后的关系

采用Kaplan-Meier法对TCGA数据库中下载的有PDRG1 mRNA数据且随访资料完整的245例结直肠癌患者进行生存分析。其中，男性133例，女性112例；年龄31～90岁，中位年龄66岁。以PDRG1 mRNA表达量中位数（65.6）为界，大于中位数者为高表达组，其余为低表达组。PDRG1 mRNA高表达组无瘤生存期短于低表达组（HR=0.519,95%CI:0.299～0.899,P=0.019），但两组总生存期比较，差异无统计学意义（HR=0.638,95%CI:0.413～1.159,P=0.097；图4）。

2.6 PDRG1的甲基化水平与mRNA表达的关系

分析DNMIVD中PDRG1甲基化数据显示，299例结肠癌组织中PDRG1启动子区甲基化水平较38例正常结肠组织降低，差异无统计学意义（P=0.145，图5A）。然而结肠癌组织中PDRG1mRNA的表达水平与PDRG1甲基化水平的相关性分析显示，PDRG1甲基化β值与基因表达水平呈负相关（r=-0.34,P<0.01；图5B）。

图3 TCGA数据库中273例结直肠癌组织中PDRG1mRNA表达与拷贝数变异的相关性

图4 TCGA数据库中245例结直肠癌患者PDRG1 mRNA表达水平对无瘤生存期和总生存期的影响

3、讨论

随着生活方式和饮食结构的改变，我国结直肠癌发病率和死亡率逐年升高。结直肠癌早期诊断对于延长患者生存期尤为重要。PDRG1基因是一种p53和DNA损伤调控基因，在全身各类组织及器官中均有表达[8,9]。研究发现，多种恶性肿瘤如睾丸癌、肺癌、结直肠癌和乳腺癌中PDRG1表达上调，同时伴随p53的表达异常[10,11]。体外实验证实，miR-214通过下调PDRG1的表达，抑制膀胱癌细胞的增殖[7]。沉默PDRG1可以抑制胃癌细胞生长，诱导其细胞凋亡[12]。本研究基于TCGA数据库分析发现，结直肠癌组织中PDRG1 mRNA表达增高，且其表达水平与肿瘤位置、远处转移和TNM分期有关，高表达PDRG1者无瘤生存期缩短。免疫组织化学结果更进一步验证，PDRG1蛋白在结直肠癌组织中高表达。PDRG1的高表达与结直肠癌患者的发展、肿瘤复发及预后有关，可作为预后评估及靶向治疗的新靶点。

图5 DNMIVD数据库分析结肠癌PDRG1基因甲基化水平与其表达水平的相关性

进一步分析发现，结直肠癌组织中PDRG1mRNA的高表达与基因CNV有关。已有研究证实，CNV与结直肠癌患者治疗反应及预后有关[13,14]。因此结直肠癌PDRG1高表达可能通过影响CNV参与结直肠癌发展进程。DNA甲基化是调控基因表达的一种重要方式，启动子区CpG岛的异常甲基化和基因转录抑制密切相关，在许多肿瘤的发生过程中是频发的早期事件[15,16]。既往研究发现，DNA甲基化水平降低与PDRG1表达增强相关[7,11]。本文采用DNMIVD在线数据库发现，结肠癌中PDRG1表达水平与PDRG1启动子甲基化β值呈负相关（r=-0.34,P<0.01），提示PDRG1表达可能受表观遗传的调控，并对结直肠癌的发展及预后产生重要影响。研究发现，PDRG1可通过调控Snail1的表达来影响上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition,EMT）过程，从而促进结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移[17]。另有研究发现，PDRG1通过调控丝裂原细胞外信号调节激酶（mitogen extracellular signal regulated kinase,MEK）/胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）/分化簇44(cluster of differentiation44,CD44）通路促进胶质母细胞瘤增殖和迁移[18]。食管癌和肺癌中PDRG1的促癌作用与共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated protein,ATM)-p53及Wnt信号通路有关[19,20]。由此可以看出PDRG1作为参与肿瘤发生和发展的关键因子，可通过调控不同信号通路在多种肿瘤中发挥作用。

综上所述，PDRG1在结直肠癌中呈高表达，且与肿瘤复发、肿瘤位置和远处转移有关，参与结直肠癌的发展进程，影响患者预后；其表达水平可能受DNA甲基化调控。PDRG1有望成为结直肠癌新型的诊断和治疗靶点，笔者拟进一步深入开展体外分子机制研究，为结直肠癌的

靶向治疗提供新的思路。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(81902466);大连市医学科学研究计划项目(1911122);

文章来源:张丽静,贾彦彦,胡波,等.结直肠癌p53和DNA损伤调节基因1的表达及临床意义[J].实用肿瘤杂志,2024,39(02):149-154.