重度抑郁症(major depressive disorder,MDD)是一种常见的精神疾病,以显著而持久的情绪低落、快感缺失和兴趣减退为核心症状,且伴有认知能力下降,包括执行功能、注意力、记忆力和推理能力等,导致患者社会功能严重受损,持续影响患者疾病预后和生活质量[1]。MDD致残率高,全球疾病负担严重[2],在过去十年间其发病率增加了约20%。MDD的病因和发病机制复杂,目前普遍认为其是多基因遗传和后天环境压力共同作用的复杂精神疾病,其发病机制包括单胺类神经递质假说、下丘脑—垂体—肾上腺轴(HPA轴)假说、神经营养因子假说、免疫和炎症因子假说、神经再生假说等[1]。 目前针对MDD主要治疗方式为基于单胺类神经递质假说开发的传统抗抑郁药物,但其在临床上存在诸多弊端,如起效慢、服用时间长、有效率低、易复发、不良反应明显、对认知功能改善效果欠佳等,因此迫切需要一种干预时间短、不良反应小、更高效的新型治疗方式。 干细胞( stem cells)是一类具有高度自我增殖和多向分化潜能的非特化细胞,具有强大的组织修复能力,干细胞及相关细胞产物疗法近年来发展为一种极具潜力的神经和精神疾病新型治疗方式[3-5]。 其中,人脱落乳牙牙髓干细胞( stem cellsfrom human exfoliated deciduous teeth,SHED)[6]具有获取来源无创、伦理争议小、来源于外胚层的神经嵴、与神经细胞具有相同起源、更强的神经分化能力、表达的神经标志物和神经营养因子水平更高等优势[6-7],近年来在包括阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的治疗研究中受到重视[7],但在精神疾病中的研究较少。 目前干细胞移植治疗的主要方式有局部给药、全身给药以及鼻内给药。 全身给药时由于血脑屏障的阻隔作用,归巢到脑部受损组织的细胞极少,而针对大脑受损部位的局部给药方式使治疗细胞较多地分布在大脑靶部位,鼻内给药途径对大脑神经系统具有较短的递送时间和较高的吸收效率。 本研究使用SHED移植治疗重度抑郁症模型WKY大鼠,分别使用脑立体定位注射和经鼻递送的方式,观察比较两种细胞递送方式对大鼠抑郁样行为的改善效果及作用机制,为针对MDD开发更高效的治疗方式提供实验基础。

1、材料和方法

1. 1实验动物

实验动物包括30只8周龄的雄性Wistar-Kyoto(WKY)抑郁模型大鼠和10只8周龄的雄性Wistar大鼠,体重(200±50) g,从北京维通利华实验动物技术有限公司购买,动物合格证号:SCXK(京)2021-0006。 所有实验动物操作均符合山西医科大学实验动物伦理委员会要求及中华人民共和国《实验动物管理条例》。 实验大鼠群养于笼中,每笼喂养2 ~ 3只,可自由获取食物和水,环境中12h交替明暗光照,温度、湿度适宜,每2 ~ 3d更换一次垫料。

1. 2细胞、试剂与主要仪器

SHED购于广州塞莱拉干细胞科技股份有限公司;DMEM/ F-12 (1∶1)、FBS培养基购于美国Gibco公司;胰蛋白酶、青链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司;TransScriptUni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMixfor qPCR和PerfectStart Green qPCR SuperMix试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司;倒置显微镜购于日本Olympus公司;实时荧光定量PCR系统购于美国Biorad公司。 脑源性神经营养因子( brainderived neurotrophic factor,BDNF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒均购于江苏晶美生物科技有限公司。

1. 3干预方案

实验大鼠进行1周的环境适应性饲养后,30只WKY大鼠分为模型组(WKY大鼠)、经鼻递送组(WKY大鼠+ SHED经鼻递送)、脑室注射组(WKY大鼠+ SHED脑室内注射),每组10只;10只Wistar大鼠为对照组。 干预方案如下:模型组和对照组不做处理;经鼻递送组:单次两侧经鼻注射递送5×105个细胞,共6μL,3μL /侧;脑室注射组:脑室内单次两侧立体定位注射5×105个细胞,共6μL, 3μL /侧,移 植 到 以 下 坐 标:前 囟 后AP - 1. 0mm,中线侧旁ML±1. 5mm,硬脑膜下DV- 4. 5mm。 四组大鼠分别于3周后进行行为学实验,以进行抑郁和认知评估。 方案示意图见图1。

图1大鼠干预示意图

1. 4行为学实验

1. 4. 1蔗糖偏好实验。

所有实验大鼠单笼喂养24h,之后开始正式实验。 整个实验过程分3d,第1天为适应阶段,前12h所有笼子上放置两瓶配比为1%的糖水,12h后将其中一瓶糖水换下,用同样的纯净水替代;第2天将两瓶水均撤下,使大鼠禁食禁水24h;第3天每个笼子分别放100mL糖水和纯净水。24h之后取下所有鼠笼上的水瓶,称量每瓶内所剩的液体,计算蔗糖偏好率(糖水摄入量/总摄入量 ×100% )。

1. 4. 2强迫游泳实验。

准备一个高为80cm,直径为40cm的圆柱形塑料容器,在容器内注入25℃ 左右温水深约40cm,使实验大鼠可以自由游动,确保周围环境安静,为防止气味的影响,每只大鼠实验后均重新换水。 对每只大鼠分别进行6min拍摄记录,其中前2min作为适应期,其表现不计入实验结果,对大鼠游泳后4min的静止不动时间进行记录。 测定指标为4min内不动时间(大鼠在水面漂浮,只有轻微的活动)在总活动时间中的百分比。

1. 4. 3旷场实验。

将大鼠放入100cm×100cm×50cm、周壁和箱底为黑色的箱内,分为中心区和外围区,使用视频跟踪分析软件自动划分。 开始实验之前使大鼠在内自由活动适应5min,同时评估大鼠的运动能力。 之后将大鼠放入中心区后开始测定,每次测定5min,每只大鼠只进行一次行为测定,实验完成后用75%乙醇擦拭干净箱底以防气味对实验结果造成影响。 测定指标为5min内中心区域停留时间在总活动时间中的百分比。

1. 4. 4 Y迷宫实验。

评价实验大鼠的空间工作能力和短期记忆能力,采用Y型三臂迷宫进行测试。标记迷宫A、B和C的臂。 将实验大鼠放在标有A的臂远端,面向迷宫中心,轻轻握住鼠的尾巴底部,让鼠不受干扰地探索迷宫8min,记录大鼠在所有臂条目和替换的数量。 交替定义为大鼠连续进入所有三个手臂。 自发交替百分比(% ) =交替次数/ (最大轮流次数- 2)×100%。

1. 5脑组织样本采集和ELISA检测

四组随机各取3只大鼠,禁食12h后采集样本,先麻醉大鼠,后腹主动脉取全血,之后快速取脑,在低温操作台上分离出海马组织,置于液氮中速冻,放于- 80℃冰箱保存待用。 严格按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作,根据标准品所得的标准曲线计算出大鼠血清和海马组织中BDNF、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 含量。

1. 6统计学方法

采用SPSS21. 0统计学软件对数据进行分析,行为学及病理指标数据使用PrismGraphPad9程序处理,数据采用均值 ± 标准差表示,采用Kolmogorov-Smirnov检验数据正态性,符合正态分布采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多组比较,P < 0. 05表示具有统计学差异。

2、结果

2. 1 SHED培养情况

复苏培养SHED至第5代用于后续脑室内立体定位注射移植和经鼻递送移植。 倒置显微镜下观察:可见SHED细胞呈不规则圆形或长梭形、漩涡状集落生长,见图2。

图2体外培养的第5代SHED,呈长梭形、贴壁漩涡状生长

2. 2各组大鼠体重变化

开始实验前,三组WKY大鼠体重差异无显著性,但由于基因和习性差异都显著低于对照组Wistar大鼠(P < 0. 001)。SHED细胞经不同方式注射后,治疗组WKY大鼠体重升高大于模型组,其中脑室内立体定位注射组的体重增加与模型组相比差异极显著(P < 0. 001);经鼻递送组体重增加也高于模型组,但与模型组相比差异无统计学意义,三组WKY大鼠在实验结束时体重都显著低于对照组Wistar大鼠( P < 0. 001 ) ,见图3。

图3大鼠实验过程中体重的变化

2. 3 SHED移植治疗改善WKY抑郁模型大鼠的抑郁样行为

在蔗糖偏好实验中,模型组比对照组蔗糖偏好指数降低(P < 0. 001);经SHED移植干预后的大鼠蔗糖偏好指数又上升,其中脑室注射组差异明显(P < 0. 001),见图4a。 强迫游泳实验中,与对照组相比,模型组静止不动时间占比增多;SHED移植干预后大鼠静止不动时间占比下降,其中脑室注射组差异明显(P < 0. 001),见图4b。 旷场实验中,模型组大鼠进入中心区域时间明显比对照组少(P < 0. 001),移植SHED后大鼠处于中心区时间增多,其中脑室注射组差异明显(P < 0. 001),见图4c。Y迷宫实验中,模型组自发交替百分比明显比对照组低( P < 0. 001 ),经脑室内立体定位注射移植SHED和经鼻注射递送SHED后大鼠自发交替百分比均上升,其中脑室注射组差异明显(P < 0. 001),见图4d。 以上行为学实验结果提示SHED移植可以有效改善WKY抑郁模型大鼠的抑郁样行为,并提高其短期记忆能力,且脑室内注射移植组比经鼻递送的方式效果更好。

图4四组大鼠行为学实验结果

2. 4 SHED移植治疗后WKY大鼠海马组织和血清炎症因子和神经营养因子含量变化

与对照组Wistar大鼠相比,模型组WKY大鼠海马组织和血清中的神经营养因子BDNF的水平均下降(P < 0. 05,P < 0. 01),SHED移植治疗后WKY大鼠海马组织和血清中BDNF水平均升高,其中脑室注射组的差异有统计学意义(P < 0. 05, P < 0. 01),见图5a。 与对照组相比,模型组WKY大鼠海马组织和血清中的抗炎因子IL-10的水平均下降,其中海马组织的下降水平显著(P < 0. 01),SHED移植治疗后WKY大鼠海马组织和血清中IL-10水平均升高,且在海马组织中脑室注射组的差异明显(P < 0. 05),见图5b。 与对照组相比,模型组WKY大鼠海马组织和血 清 中 的 促 炎 因 子IL-1β 的 水 平 均 升 高(P < 0. 01),SHED移植治疗后WKY大鼠海马组织和血清中IL-1β 水平均下降,其中脑室注射组的差异明显(P < 0. 05),见图5c。 与对照组相比,模型组WKY大鼠海马组织和血清中的促炎因子IL-6的水平均升高(P < 0. 01),SHED移植治疗后WKY大鼠海马组织和血清中IL-6水平均下降,其中脑室注射组在海马组织和血清中的差异都显著(P < 0. 01),而 经 鼻 递 送 组 在 海 马 组 织 中 的 差 异 明 显(P < 0. 05),见图5d。 与对照组Wistar大鼠相比,模型组WKY大鼠海马组织和血清中的促炎因子TNFα 的水平均升高(P < 0. 01), SHED移 植 治 疗 后WKY大鼠 海 马 组 织 和 血 清 中TNF-α 水 平 均 下降,其中脑室注射组的差异显著( P < 0. 01 ) ,见图5e。

图5四组大鼠海马组织和血清中BDNF、IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α 的含量比较

3、讨论

MDD重度抑郁症不仅给患者带来巨大痛苦,还给社会带来严重的疾病负担,已成为全球性的健康问题。 目前MDD的主要治疗手段是以选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRIs)为代表的药物治疗,然而,接受SSRIs治疗的患者只有50%左右症状得到改善,且起效慢[8]。 为发现针对重度抑郁症更有效的治疗策略,相关临床前动物模型的选择应能最大限度模拟MDD患者的行为和神经生物学表型。 既往研究抑郁症的动物模型多以各种压力应激诱导,抑郁样行为消退快,个体差异大,诱发的抑郁样行为具有明显的异质性,进而影响对MDD病理机制探索和药物疗效观察。 而WKY大鼠是MDD的内源性应激易感模型,WKY大鼠的行为、神经化学和内分泌与MDD有相似之处,具体来说,WKY大鼠表现出增加的抑郁样行为,以及血清素能、谷氨酸能、多巴胺能和神经营养系统的改变,新兴研究表明神经炎症也参与其中[9-11],且WKY大鼠表现出对传统抗抑郁药物的耐药性,因此,WKY大鼠作为重度抑郁症的优势模型为研究MDD的病理生理学及探索有效的治疗策略提供了更有价值的工具。 本次研究中经SPT、FST、OFT和Y迷宫这些行为实验表明WKY大鼠较Wistar大鼠具有明显的抑郁样行为和短期记忆受损等认知功能下降表现,符合MDD的典型症状指标。

近年来神经炎症在MDD发生发展中的作用越来越引发人们关注,炎症因子能穿过血脑屏障进而引发炎症级联反应,导致神经细胞焦亡,影响神经再生,最终导致大脑结构和功能的改变。 大量临床研究[12-17]发现MDD患者血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α 水平显著高于正常对照组,而抗炎因子IL-10和神经营养因子BDNF水平显著低于正常对照组。 经过抗抑郁治疗后,MDD患者血清中炎性细胞因子的蛋白质浓度降低,而抗炎细胞因子的蛋白质浓度升高[17-18]。 本项研究发现WKY抑郁模型大鼠海马组织和血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α 水平均较对照组Wistar大鼠升高,而抗炎细胞因子IL-10和神经营养因子BDNF水平均较对照组降低,这一结论与上述临床实验结果符合,再次表明抑郁样行为与神经炎症有关。

SHED是一种来源于外胚层神经嵴的成体多能干细胞[19],可通过强大的旁分泌作用和外泌体途径,产生大量细胞因子、化学分子和生长因子来调节组织微环境,具有免疫抗炎、营养和保护神经、促进神经再生等作用,近年来在包括阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的治疗研究中受到重视[7],但在精神疾病中的应用较少,且目前对于干细胞递送方式的争议较多。 本项研究着眼于解决以上问题,使用SHED干细胞移植治疗WKY抑郁模型大鼠,并比较脑室内注射和经鼻递送两种方式的效果,为干细胞治疗的临床转化提供实验基础。 本项研究发现经SHED干细胞移植治疗后,两种干细胞递送方式组的WKY大鼠抑郁样行为均得到缓解,但只有脑室注射组的差异有统计学意义,同时两组WKY大鼠海马组织和血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α 水平均下降,抗炎细胞因子IL-10和神经营养因子BDNF水平均升高,但总体上只有脑室注射组的差异有统计学意义。 本项实验结果一方面表明了SHED移植治疗的抗抑郁效果,并提示SHED可能是通过调节免疫、抗炎和营养神经的方式来发挥抗抑郁作用;另一方面提示经脑室注射SHED较经鼻递送方式具有更好的疗效。 干细胞移植治疗的递送方式一直是相关临床转化研究的热点。 由于血脑屏障作用,全身给药移植治疗到达大脑目标区域的干细胞数量极少,而局部给药可针对大脑靶部位进行细胞递送,其中经脑室注射移植治疗可将治疗细胞靶向递送到大脑受损区域,但经脑室注射方式是一种有创治疗方式,临床实践中有并发脑水肿和脑出血等风险。 经鼻递送具有较短的递送途径,是近年来新发展起来的一种递送方式,具有无创高效的优势,但本项研究中经鼻递送SHED组的治疗效果不甚明显,考虑由于干细胞本身体积较大,经鼻递送的吸收率较低,有研究表明[19-20]干细胞可通过旁分泌和释放外泌体的方式来发挥修复组织损伤的作用,而外泌体的体积相对较小,经鼻递送的吸收效率较干细胞高,未来可考虑将干细胞外泌体经鼻递送到神经系统来发挥效用。

本项研究表明脑室注射组的治疗效果较高,脑室内注射更有利于干细胞在大脑受损部位发挥作用,但考虑到其有创性和不良反应,未来应考虑更精准的手术方式以减少脑水肿和脑出血等并发症,提高治疗效果。 总的来说,SHED移植治疗WKY抑郁模型大鼠展现出了明显的抗抑郁效果,在未来临床转化上,细胞注射治疗以脑室内注射方式的吸收效率和改善效果明显,但应注意提高手术精准性以降低发生并发症的风险。

基金资助:长治医学院附属和平医院2020年度院级科研基金(HPYJ202039);国家自然科学基金面上项目(82371511);

文章来源:于菲,许成岗,刘莎,等.不同移植方式下人脱落乳牙牙髓干细胞对WKY抑郁大鼠的治疗作用[J].医学理论与实践,2025,38(06):901-905.