牙齿缺失是口腔诊疗中的常见问题｡据估计,我国约有20亿颗缺失牙的修复需求[1]｡牙科种植体,也称人工牙根,是用于替换缺失牙齿的医疗设备,具有高成功率和高存活率的优点｡统计显示,种植体修复的成功率在90%以上,十年存留率在97%左右[2-4]｡然而,种植体修复同样伴随着并发症风险[4]｡种植体周围炎(peri-implantitis,PI)是一种主要由菌斑为始动因素的并发症,临床表现为牙龈充血､水肿和探诊出血,并伴有溢脓以及骨吸收等症状[5]｡碘化丙啶(propidiumiodine,PI)造成的种植体周袋和周围牙槽骨的吸收,导致了种植牙的松动､脱落,成为种植体修复失败的主要原因[6]｡其中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis,Pg)是种植体周围主要致病菌之一,在整个炎症发展过程中发挥显著作用｡牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts,hGFs)是牙龈结缔组织中的主要细胞类型,参与合成胶原纤维､弹性纤维及基质,对于维持牙龈的结构和功能至关重要[7]｡

在前期研究中,利用GSE57631芯片对6例PI患者的牙龈组织和正常牙龈组织进行了基因检测,生物信息学分析发现了差异基因核因子κB亚基1(nuclearfactorkappaBsubunit1,NFKB1),以及NOD样受体(NOD-likereceptor,NLRP)信号通路可能参与了PI发生｡研究表明,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nod-likereceptorprotein3,NLRP3)炎症小体,主要由NLRP3､凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociatedspeck-likeproteincontainingacaspaseactivatingrecruitmentdomain,ASC)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinylaspartatespecificproteinase-1,Caspase1)三种蛋白组成,与炎症反应的关系最为密切[8,9]｡此外,NLRP3炎症小体产生的Caspase-1具有裂解白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及启动和控制细胞焦亡的功能[10]｡因此,本研究采用人原代牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts,hGFs)作为研究对象,用Pg共培养模拟炎症发生,探究NLRP3炎症小体在hGFs炎症刺激中的作用机制｡

1、材料与方法

1.1细胞培养hGFs购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司(货号:HUM-iCell-m005),在原代成纤维细胞基础培养基(赛百慷,货号:PriMediCELL-003)中培养,添加10%胎牛血清(FBS,Gibco)和1%青霉素-链霉素｡Pg购于ATCC(货号:33277)｡参照文献[11]方法,Pg在37℃､厌氧环境(10%H2､10%CO2和80%N2)下培养保存｡

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂与抗体LipofectamineTM3000(Invitrogen,货号:L3000-008);Opti-MEM培养基(Gibco,货号:31985-070);BMS-986299(MCE,货号:HY-139396230547);细胞凋亡试剂盒(BD,货号:556547);TNF-α试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司,货号:RX104793H);IL-6试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司,货号:RX106126H);IL-1β试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司,货号:RX106152H);抗体:NLRP3(Affinity,货号:DF7438;1∶1000);pro-Caspase-1(Abcam,货号:ab179515;1∶1000);Caspase-1(Affinity,货号:AF5418;1∶1000);ASC(Santa,货号:sc-514414;1∶1000);pro-IL-1β(Affinity,货号:AF5103;1∶1000);p-NF-κB(Affinity,货号:AF2006;1∶1000);NF-κB(Affinity,货号:AF5006;1∶1000);GSDMD(Affinity,货号:AF4012;1∶1000);Anti-rabbitIgG,辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)-linkedAntibody(CST,货号:7074;1∶1000);β-actin(Proteintech,货号:81115-1-RR;1∶10000);磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)(Proteintech,货号:10494-1-AP;1∶10000);重组Anti-NLRP3抗体(abcam,货号:ab270449;1∶50);羊抗兔lgGH&L(AlexaFluor594)(abcam,货号:ab150080;1∶500);4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6'-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(Sigma,货号:D9542-10MG)｡1.2.2仪器细胞培养箱(Thermo,型号:BB150);低温高速离心机(Thermo,型号:Micro17R);光学显微镜(宁波舜宇仪器有限公司,型号:ICX41);倒置荧光显微镜(尼康,型号:Ts2-FC);流式细胞仪(安捷伦,型号:NovoCyte);酶标仪(MD,型号:CMaxPlus);电泳仪(伯乐,型号:PowerPacTMBasic);电泳槽(伯乐,型号:10025025);快速湿转仪(GenScript,型号:eBlotL1);化学发光仪(勤翔,型号:610020-9Q)｡1.3NLRP3siRNA转染及细胞造模和药物干预转染与检验取对数生长期的hGFs,以4×105/mL的密度接种于6孔培养板,加入2mL工作液,培养至细胞融合度70%~90%时进行转染｡使用Opti-MEM培养基稀释的LipofectamineTM3000,与1∶1的NLRP3siRNA混匀,室温孵育10~15min后,吸去培养基,用无血清培养基清洗细胞2次后加入无血清培养基｡接着,加入质粒脂质体复合物,细胞放入培养箱孵育4~6h后,更换含血清培养液以去除复合物,并继续培养至24~48h后,通过Westernblot检测NLRP3表达情况,验证转染效率｡

炎症诱导:将经过转染验证的hGFs以3×105/mL的密度种于6孔板,使之附着后,在没有抗生素的培养基中培养过夜,然后加入感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为100的Pg共培养24h｡

细胞分组:对照组:si-NCRNA转染,空白培养基对照;模型组:si-NCRNA转染,Pg共培养诱导炎症;NLRP3沉默组:si-NLRP3RNA转染,Pg共培养诱导炎症;BMS-986299组:si-NLRP3RNA转染,在Pg共培养之前,加入1μmol/LNLRP3激动剂BMS-986299预处理1h,再Pg共培养诱导炎症｡1.4流式细胞术检测凋亡取对数生长期的hGFs,制成细胞悬液,以1.2×106/mL的密度接种于6孔板,培养过夜｡根据组别处理各组细胞24h后,预冷PBS洗涤2次,调整细胞浓度为1×106/mL后,使用细胞凋亡试剂盒,按照使用说明书操作,加结合缓冲液离心后加入试剂盒中膜联蛋白V(AnnexinV)-荧光素异硫氰酸酯(fluoresceinisothiocyanate,FITC)与碘化丙啶(propidiumiodine,PI),避光孵育15min,加入结合缓冲液后使用流式细胞仪检测细胞凋亡｡所有样本均在1h内完成检测,实验重复3次｡

1.5ELISA法检测各组细胞上清中炎症因子含量hGFs根据分组处理24h后,收集细胞培养液上清,以2000r/min离心20min,取上清,放入-80℃冰箱保存｡样本使用相应的ELISA试剂盒检测IL-1β､IL-6和TNF-α的含量｡

1.6Westernblot检测细胞中相关蛋白表达水平参照文献提取hGFs中总蛋白,BCA法测定浓度,经变性､电泳､转膜､封闭后,加入对应的一抗､二抗孵育,ECL化学发光仪显影并分析灰度值,计算相对表达水平｡

1.7免疫荧光检测在无菌高洁净度盖玻片中,以60%~70%细胞密度种板｡待细胞贴壁后,根据分组进行处理24h｡弃去培养液后,加入1mL预冷的4%多聚甲醛,固定10min后PBS漂洗;加入1mL0.5%TritonX-100处理2min,PBS漂洗;3%BSA封闭0.5h;加入重组Anti-NLRP3抗体4℃孵育过夜,PBS漂洗;加入80μL羊抗兔lgGH&L(5%羊血清稀释),室温下避光孵育1h,吸弃二抗;加入DAPI染色后制片封片,镜下观察｡

1.8统计学分析使用SPSS20.0统计软件进行数据分析,如果数据符合正态分布且方差齐,则使用One-wayANOVA单因素方差分析进行检验,组间采用Tukey检验两两比较;若数据符合正态分布但方差不齐,则使用Dunnett’sT3检验;若数据不符合正态分布,则使用Kruskal-WallisH检验｡显著性水平α=0.05｡所有数据以xs表示,P0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1Westernblot验证质粒效率本研究使用Westernblot检测NLRP3蛋白的表达水平,以检验质粒转染效率｡如图1所示,si-NLRP3转染组相较于空载体转染组,NLRP3表达显著降低(0.504±0.092vs.1.000±0.067,P<0.01),表明质粒成功导入,NLRP3沉默模型构建成功｡

图1Westernblot检测验证转染效率

2.2NLRP3敲除降低了hGFs的凋亡率流式细胞术结果显示,模型组中hGFs的凋亡率相较于对照组显著上升[(22.66±1.97)%vs.(4.46±0.93)%,P<0.01;n=3],表明Pg共培养导致细胞凋亡率上升｡然而,NLRP3沉默组相较于模型组,hGFs凋亡率显著降低[(12.34±1.37)%vs.(22.66±1.97)%,P<0.01;n=3],同时,在使用NLRP3激动剂BMS-986299刺激后,hGFs的凋亡率显著上升[(18.51±1.45)%vs.(12.34±1.37)%,P<0.01;n=3]｡结果表明,NLRP3参与了Pg诱导的细胞凋亡｡

2.3NLRP3沉默抑制了hGFs中炎症反应应用ELISA法检测细胞上清中炎症因子含量,从而评估hGFs中炎症水平｡如表1所示,Pg共培养后细胞上清中IL-1β､IL-6和TNF-α等炎症因子含量显著上升(P<0.01),表明Pg诱导炎症反应;而NLRP3沉默后,炎症因子显著下降(P<0.01),而NLRP3激动剂则逆转了NLRP3沉默的效果｡

表1各组hGFs中炎症因子含量

表2各组NLRP3炎症小体相关蛋白相对表达

表3各组hGFs蛋白相对表达水平

2.4NLRP3敲除抑制了NLRP3炎症小体相关的蛋白表达使用Westernblot检测了与NLRP3炎症小体组成相关的蛋白,NLRP3､ASC､Caspase-1以及pro-Caspase-1在hGFs中的相对表达情况(图2)｡如表2所示,各组中无活性的前体蛋白pro-Caspase-1的相对表达量无显著差异｡然而,Pg诱导的炎症令模型组中NLRP3蛋白,以及其下游的ASC和Caspase-1的表达水平,均显著提高,表明hGFs中NLRP3炎症小体激活;而NLRP3沉默组相较于模型组,NLRP3､ASC和Caspase-1表达显著降低,说明炎症小体激活受抑制;NLRP3激动剂BMS-986299的使用则逆转了NLRP3沉默所导致炎症小体激活抑制,表现为NLRP3和ASC的表达相对NLRP3沉默组上升｡

2.5NLRP3沉默抑制了hGFs中的细胞焦亡应用Westernblot检测pro-IL-1β以及细胞焦亡相关的蛋白表达(图3)｡各蛋白相对表达量如表3所示,模型组pro-IL-1β和GSDMD的表达水平以及NF-κB的磷酸化水平均相较于对照组显著提高;而NLRP3沉默组相较于模型组,pro-IL-1β和GSDMD的表达水平以及NF-κB的磷酸化水平均显著降低;BMS-986299干预后,pro-IL-1β和GSDMD的表达水平以及NF-κB的磷酸化水平显著上升｡

图2NLRP3､pro-Caspase-1､Caspase-1以及ASC的蛋白条带

图3pro-IL-1β､p-NF-κB､NF-κB以及GSDMD的蛋白条带

图4免疫荧光检测定位hGFs中NLRP3炎症小体

2.6NLRP3沉默降低hGFs中炎症小体数量最后我们通过免疫荧光检测hGFs中NLRP3定位,从而间接检测炎症小体表达情况｡如图4所示,模型组中NLRP3荧光强度相较于对照组显著上升(36.38±3.38vs.15.68±1.50,P<0.01;n=3),而NLRP3沉默组相较于模型组NLRP3荧光强度显著下降,(22.92±1.83vs.36.38±3.38,P<0.01;n=3),与Westernblot结果类似,BMS986299干预后NLRP3荧光强度显著上升(29.65±1.97vs.22.92±1.83,P<0.01;n=3)｡

3、讨论

基于本研究结果,推测NLRP3炎症小体可以通过激活炎症以及细胞焦亡,对hGFs造成损伤,从而诱发炎症刺激｡

PI的发生与病原微生物相关,研究表明,种植体周围组织的微生物感染或者其他PI风险因素,导致种植体周围组织的局部炎症,从而诱导破骨细胞前体向炎症部位聚集,最终引起骨吸收以及种植体松动､脱落[12]｡此外Pg是一种重要的牙周致病菌,它在牙周炎的发生和发展中起着关键作用,因此常用于牙周疾病造模[13]｡在本研究中,ELISA结果表明,Pg共培养诱导了炎症反应,促进hGFs凋亡,激活了NLRP3炎症小体｡

NLRP3炎症小体,主要由NLRP3､ASC以及Caspase-1三种蛋白组成[8]｡在NLRP3炎症小体经典激活途径中,在多种病原体相关分子模式刺激下,NF-κB被激活,诱导NLRP3和促炎因子(如pro-IL-1β)的转录,并促进NLRP3去泛素化和自解离｡随后,NLRP3被第二信号激活后,招募ASC和pro-Caspase-1组成炎症小体,并剪切生成Caspase-1[14]｡据报道,Caspase-1可以将pro-IL-1β加工为有活性的IL-1β,进而促进炎症反应[15]｡此外,Caspase-1也被报道激活GSDMD,在细胞膜上形成孔洞,最终造成细胞焦亡[16]｡在本研究中,Westernblot结果显示,Pg共培养诱导了炎症因子并促进pro-IL-1β的表达,同时提升了NLRP3､ASC和Caspase-1表达,表明NLRP3炎症小体激活,以及下游的总GSDMD蛋白表达升高｡同时,综合Westernblot和免疫荧光的结果,发现上述的炎症反应和相关蛋白的激活,在NLRP3沉默后均受到显著抑制｡然而,NLRP3炎症小体和GSDMD的抑制,则在NLRP3炎症小体激动剂BMS-986299干预后逆转,并观察到细胞凋亡率与炎症因子含量的上升｡因此,推测NLRP3通过激活NLRP3炎症小体,促进hGFs的细胞焦亡,最终诱导炎症刺激｡然而,本实验设计仍然存在一些缺陷,例如,没能探讨NLRP3过表达对hGFs炎症刺激的影响｡在未来的研究中,将会设置一个NLRP3过表达的hGFs组,不加入Pg共培养,探究过表达的NLPR3炎症小体能否诱导炎症与细胞焦亡｡

此外,许多研究表明,IL-1β和NF-κB参与了骨吸收代谢｡在破骨细胞分化过程中,NF-κB被破骨细胞分化因子激活后靶向细胞质蛋白1,参与破骨细胞分化,促进骨吸收过程[17]｡同时,据Otsuka等[18]报道,IL-1β在小鼠间质干细胞中,在NF-κB配体受体激活后,增加了非破骨细胞中胰岛素样生长因子2和趋化因子的表达,促进了破骨细胞生成｡本实验中,ELISA和Westernblot的结果分别表明IL-1β的含量和NF-κB的磷酸化水平与NLRP3炎症小体表达呈正相关｡因此推测NLRP3炎症小体在激活炎症之外,还可能通过IL-1β促进破骨细胞分化,从而造成牙槽骨破坏,最终导致牙科种植体松动､脱落｡但此猜想还需要进一步的实验验证｡

总而言之,基于上述体外模型的研究结果,证明了NLRP3可以激活NLRP3炎症小体和炎症相关通路,诱导炎症形成,同时也能够促进hGFs细胞焦亡｡因此,我们推测,诱导细胞焦亡可能是NLRP3炎症小体参与hGFs炎症刺激的机制之一,但仍需要未来进一步的深入研究进行验证｡

参考文献:

[1]单验博,乔波,杨烁,等.口腔种植体新材料的研究进展[J].解放军医学院学报,2023,44(1):74-78.

[2]向梅,张雪舟,吴静,等.种植体失败位点再种植存留情况及相关因素探讨[J].临床口腔医学杂志,2024,40(6):355-358.

[3]金文静,张媛,张杰夫,等.种植体周围黏膜炎和种植体周围炎危险因素分析[J].临床口腔医学杂志,2024,40(6):351-354.

基金资助:杭州市农业与社会发展科研项目(编号:2022509508);

文章来源:张黄,苗瑞婧,范旭升,等.探究NLRP3炎症小体对人原代牙龈成纤维细胞炎症刺激的影响[J].口腔医学研究,2025,41(02):128-133.