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D/L-缬氨酸与牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的关系研究

2020-08-15 297 上传者：管理员

摘要：目的:研究D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用。方法:通过CCK-8实验获得无细胞毒性的D-缬氨酸浓度;通过生长曲线实验评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌细菌活性的作用;通过结晶紫染色实验、胞外多糖实验和扫描电镜评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的抑制作用和对成熟牙龈卟啉单胞菌生物膜的分散作用。结果:D-缬氨酸在浓度为50mmol/L和75mmol/L时对成纤维细胞无细胞毒性;D-缬氨酸(75mmol/L)能有效抑制牙龈卟啉单胞菌的细菌活性和生物膜的形成,并分散成熟的生物膜。D-缬氨酸(50mmol/L)在72h内抑制牙龈卟啉单胞菌的生物活性和生物膜的形成。L-缬氨酸(75mmol/L和50mmol/L)促进牙龈卟啉单胞菌的细菌活性和生物膜的形成。当D-缬氨酸和L-缬氨酸同时存在时,仅表现出D-缬氨酸的作用。结论:D-缬氨酸具有抑制牙龈卟啉单胞菌细菌活性和生物膜形成,并分散成熟生物膜的作用;L-缬氨酸能促进牙龈卟啉单胞菌的细菌活性和生物膜的形成,但其作用与D-缬氨酸不相拮抗。D-缬氨酸可作为治疗菌斑生物膜相关疾病的潜在生物制剂。

关键词：
D-氨基酸
D-缬氨酸
口腔
牙龈卟啉单胞菌
生物膜
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种植体周围炎和牙周炎是造成种植体脱落和牙体缺失的主要疾病[1],种植体周围炎和牙周炎的治疗是维护口腔健康的关键。致病菌菌斑生物膜的形成是种植体周围炎和牙周炎的始动因素[2],生物膜形式致病菌的致病性和耐药性是游离致病菌的500倍[3]。牙龈卟啉单胞菌是种植体周围炎和牙周炎的主要致病菌[4,5]。牙龈卟啉单胞菌通过分泌脂多糖,牙龈蛋白酶和凝血酶等细胞外基质紧密连接成膜状结构抵抗宿主免疫反应[6,7],对牙龈卟啉单胞菌生物膜的清除,是治疗种植体周围炎和牙周炎的关键。临床上对其治疗方法主要有机械清理菌斑、激光治疗和联合抗生素药物治疗[8]。然而,机械处理和不适当波长的激光易破坏种植体表面和牙齿表面结构,影响上皮的再附着[9]。联合抗生素治疗在临床上具有一定的效果,但抗生素的应用可能造成耐药菌株突变仍是不容忽略的问题。因此,寻找一种有效控制致病菌斑并不产生细菌耐药性的生物制剂对种植体周围炎和牙周炎的治疗至关重要。

近年来,D-氨基酸与L-氨基酸对细菌及其生物膜的作用成为研究热点[10,11,12]。氨基酸是组成生命物质的基本结构,不会造成细菌基因突变而产生耐药菌株。学者提出,L-氨基酸能促进细菌活性和菌斑生物膜的形成[13]。作为L-氨基酸的手性异构分子,我们猜想D-氨基酸可能抑制细菌活性和抑制菌斑生物膜的形成。本项目组前期研究发现,在共培养3天时,D-缬氨酸(50～150mmol/L)可以抑制牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜的形成,并呈现浓度依赖性[14]。但D-缬氨酸的细胞毒性尚未被报道。D-缬氨酸作用于细菌或仅抑制菌斑生物膜的形成仍不明确,D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用亦未被阐述。本研究拟通过CCK-8实验探讨D-缬氨酸的细胞毒性;通过探讨D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用,获得能有效抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成和分散成熟生物膜的D-缬氨酸浓度。以期为D-缬氨酸作为治疗种植体周围炎和牙周炎的潜在生物制剂提供理论基础。

1、材料与方法

1.1D/L-缬氨酸培养基的配制与实验分组

细胞实验:D-缬氨酸(D-valine,D-val)溶解于细胞培养基中(50/75/100/125/150mmol/L),经0.22μm滤器过滤备用,对照组为单纯细胞培养基。细菌实验:D-缬氨酸与L-缬氨酸(L-valine,L-val)溶解于牙龈卟啉单胞菌培养基中,浓度和分组如下:D-val/50mmol/L,L-val/50mmol/L,D-val+L-val/50mmol/L+50mmol/L,D-val/75mmol/L,L-val/75mmol/L,D-val+L-val/75mmol/L+75mmol/L,对照组为单纯牙龈卟啉单胞菌培养基。

1.2D-缬氨酸细胞毒性实验

小鼠成纤维细胞(L929)100μL以浓度5×104Cells/mL培养于96孔板。培养1d后换液为含有不同浓度D-缬氨酸的培养基继续培养,每天换液。在培养后的第1、3、5天,通过CCK-8实验检测不同浓度的D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞细胞增殖的影响。无细胞毒性的D-缬氨酸浓度用于后续研究。

1.3D/L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌活性的影响

不同浓度的D-缬氨酸与L-缬氨酸与对数生长期的牙龈卟啉单胞菌(1.0×108CFU/mL,A=600)共培养于试管中,紫外分光光度计在600nm波长下每12h测定其浊度,持续至144h,记录实验数据并绘制时间-生长曲线。

1.4生物膜形成量实验

采用传统的结晶紫染色实验评估生物膜的形成和成熟生物膜的分散情况。生物膜形成抑制实验:将不同浓度的D-缬氨酸与L-缬氨酸与对数生长期的牙龈卟啉单胞菌共培养于96孔板内(1.0×108CFU/mL,A=600),每组5个副孔,分别在培养3d和5d后采用结晶紫染色法评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的作用。成熟生物膜的分散实验:对数生长期的牙龈卟啉单胞菌96孔板内培养(1.0×108CFU/mL,A=600),3d后形成成熟的牙龈卟啉单胞菌生物膜。去掉培养基保留孔板底部生物膜,更换含不同浓度的D-缬氨酸与L-缬氨酸的培养基培养3d,采用结晶紫染色法评估D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的分散作用。

1.5胞外多糖实验和扫描电镜观察生物膜结构

采用硫酸-苯酚法测定胞外多糖,本实验中紫外分光光度计和酶标仪标定波长为490nm。以不同浓度葡萄糖(0、10、20、30、40、60、80、100mg/L)绘制多糖标准曲线。扫描电镜观察生物膜结构实验中紫外分光光度计标定波长为600nm,采用24孔板培养牙龈卟啉单胞菌。生物膜形成抑制实验与成熟生物膜的分散实验分组及培养方式同结晶紫染色实验。实验步骤和操作方法同项目组前期研究[14,15]。

1.6统计学分析

使用SPSS24.0进行统计学分析,检测数据正态分布后,组间比较才有用方差分析,以P<0.05为有统计学意义。使用Prism-graphpad8.0进行数据分析和统计图绘制。

2、结果

2.1D-缬氨酸细胞毒性实验

本实验采用CCK-8法通过评估不同浓度D-缬氨酸对L929细胞增殖的影响,以研究D-缬氨酸对L929细胞的细胞毒性。结果如图1:培养第1、3、5天与对照组相比,D-缬氨酸在浓度为50mmol/L和75mmol/L时对L929细胞增殖的影响无显著性差异(P>0.05);D-缬氨酸在浓度为100mmol/L,125mmol/L和150mmol/L时对L929细胞增殖的影响具有显著性差异(P<0.05)。浓度为50mmol/L和75mmol/L和D-缬氨酸被用于进一步研究。

图1D-缬氨酸细胞毒性实验结果

2.2D-缬氨酸和L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌活性的影响

本实验通过测定不同浓度的D-缬氨酸和L-缬氨酸与牙龈卟啉单胞菌共培养后的生长曲线,评估D-缬氨酸和L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生长的影响。结果如图2:空白对照组在培养72h后浊度达到峰值,并持续12h后浊度开始下降,在96～144h内浊度保持。与对照组相比:加入L-缬氨酸组(50mmol/L,75mmol/L),生长曲线峰值在培养60h后出现,随即浊度开始下降,在96～144h内浊度保持与对照组无差异;加入50mmol/LD-缬氨酸组,生长曲线在60h前细菌浊度未见明显增长,60h后开始增加,并在108～144h保持,持续浊度与对照组无差异;加入75mmol/LD-缬氨酸组,细菌浊度在培养144h内无增长。加入D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组实验结果等同于仅加入D-缬氨酸组。

2.3生物膜形成实验

结晶紫染色分析结果如图3,生物膜形成抑制实验:共培养3d后,D-缬氨酸组(50mmol/L,75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(50mmol/L,75mmol/L)与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。L-缬氨酸(50mmol/L,75mmol/L)与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。共培养5d后,D-缬氨酸组(75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(75mmol/L)与对照组相比具有显著性差异(P<0.05);其他组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。生物膜分散实验:D-缬氨酸组(75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(75mmol/L)与对照组相比具有显著性差异(P<0.05);其他组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。

图2D/L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌细菌活性的影响

图3结晶紫染色结果

图4胞外多糖测定结果

图5生物膜形成抑制实验电镜图

图6生物膜形成抑制实验电镜图

图7成熟生物膜分散实验电镜图

2.4D-缬氨酸和L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌胞外多糖的影响

标准曲线如图4a,胞外多糖分析结果如图4b。生物膜形成抑制实验:共培养3d后,D-缬氨酸组(50mmol/L,75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(50mmol/L,75mmol/L)与对照组相比胞外多糖含量明显较少,并具有显著性差异(P<0.05)。L-缬氨酸(50mmol/L,75mmol/L)与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。共培养5d后,D-缬氨酸组(75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(75mmol/L)与对照组相比胞外多糖量明显低于对照组,并具有显著性差异(P<0.05);其他组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。生物膜分散实验:D-缬氨酸组(75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(75mmol/L)胞外多糖量显著低于对照组(P<0.05);其他组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。

2.5扫描电镜观察牙龈卟啉单胞菌生物膜

不同浓度D-缬氨酸和L-缬氨酸对牙龈生物膜影响电镜图如图5、6、7所示。生物膜形成抑制实验:对照组培养第3天和第5天菌层厚度均大于4层,且细菌间相互附着,连接紧密。与对照组相比,培养3d后D-缬氨酸组(50mmol/L,75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(50mmol/L,75mmol/L)生物膜细菌层数少于1层,细菌间无紧密连接。孵育5d后D-缬氨酸组(75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(75mmol/L)牙龈生物膜细菌层数少于1层,细菌间无紧密连接。D-缬氨酸组(50mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(50mmol/L)牙龈生物膜细菌组细菌层数大于3层,再次形成紧密连接膜状结构。3d和5d时,L-缬氨酸组(50mmol/L,75mmol/L)牙龈卟啉单胞菌菌层数均大于对照组,细菌间附着良好,紧密连接。分散试验结果表明,D-缬氨酸组(75mmol/L),D-缬氨酸与L-缬氨酸混合组(75mmol/L)细菌层数均小于2层,无完整生物膜结构,其他实验组菌群层数仍大于4层。

3、讨论

牙龈卟啉单胞菌是种植体周围炎和牙周炎的主要致病菌,并主要以菌斑生物膜形式附着在种植体颈部和牙颈部表面[16],菌斑生物膜通过分泌细胞外多糖等基质使细菌彼此间紧密连接以抵御系统免疫反应[7]。牙龈卟啉单胞菌生物膜的清除是治疗牙周炎和种植体周围炎的关键。临床上将盐酸米诺环素作为治疗牙周炎的金标准,但其酸性微环境和仅能杀菌而不能清除菌斑生物膜仍存在一定的应用局限性[14,17],找到一种不产生细菌耐药性,并可以分散菌斑生物膜的生物制剂至关重要。

近期研究发现D-氨基酸和L-氨基酸可能具有影响细菌生长和生物膜形成的作用,提示氨基酸类可能有望成为控制菌斑生物膜的有效生物制剂。L-氨基酸是多肽和蛋白质的基本组成结构[18],具有良好的生物安全性。D-氨基酸作为L-氨基酸的手性异构分子,其对于细菌的作用存在较大争议。学者提出,D-氨基酸在低浓度下不抑制铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜的形成[12,19],也有研究表明,D-氨基酸可以抑制细菌生物膜的形成,不同种类的D-氨基酸对于不同的细菌作用有所不同[20]。本实验拟探究不同浓度的D-缬氨酸与L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用,以明确其治疗种植体周围炎和牙周炎的潜在价值。

本实验及项目组前期实验结果表明:D-缬氨酸在浓度>50mmol/L时可以抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成,其抑制效果呈浓度依赖性。D-缬氨酸的生物安全浓度为≤75mmol/L。50mmol/L的D-缬氨酸在3d内可以抑制牙龈卟啉单胞菌的细菌活性和牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成,超过3天后其作用减弱,50mmol/L的D-缬氨酸不具有分散成熟牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用。提示D-缬氨酸可以作为一种潜在的治疗菌斑生物膜的药物,在预防性抑制生物膜形成中可以应用低浓度的D-缬氨酸,但要考虑其半衰期和释放。75mmol/L的D-缬氨酸在3d和5d时均可抑制牙龈卟啉单胞菌的活性和牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成并可以分散成熟牙龈卟啉单胞菌生物膜。提示在治疗生物膜性种植体周围炎和牙周炎时可以应用生物安全范围内的高浓度D-缬氨酸。

12-缬氨酸可以促进牙龈卟啉单胞菌细菌活性及其菌斑生物膜的形成。当D-缬氨酸与L-缬氨酸同时存在时,仅表现为D-缬氨酸的作用,而L-缬氨酸的作用被掩盖,即D-缬氨酸与L-缬氨酸的作用不相拮抗。提示D-缬氨酸与L-缬氨酸可能有不同的作用位点或作用方式,且D-缬氨酸的作用位点位于L-缬氨酸上游。胞外多糖作为细菌胞外基质的主要成分与生物膜的完整性密切相关[21],D-缬氨酸加入后,胞外多糖的量显著减少,而L-缬氨酸加入后,细菌胞外多糖的量显著增加,提示缬氨酸可能与牙龈卟啉单胞菌胞外多糖产生有关。

综上所述,D-缬氨酸通过抑制牙龈卟啉单胞菌的细菌活性而抑制生物膜的形成和分散成熟的生物膜,即表现出一定的抑菌性;D-缬氨酸可能通过减少牙龈卟啉单胞菌胞外多糖的产生而抑制生物膜的形成和分散成熟的生物膜。L-缬氨酸可能通过促进牙龈卟啉单胞菌细菌活性或增加胞外多糖的量而促进生物膜的形成。

本研究证明了D-缬氨酸具有良好的生物安全性、抑菌性、抑制生物膜形成和分散成熟生物膜的作用。提示D-缬氨酸可以作为预防和治疗牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜疾病的生物制剂。但D-缬氨酸在口内微环境下是否能抑制和分散复杂菌斑生物膜仍需进一步研究。

参考文献：

[15]全旭,许彤彤,张慧彦,等.D-组氨酸抑制变异链球菌生物膜作用的研究[J].口腔医学研究,2019,35(2):176-179.

张慧彦,李保胜,张震阳,韩春雨,李尊泰,齐晓爽,付齐月,孟维艳.D/L-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌及其生物膜的作用[J].口腔医学研究,2020,36(07):648-653.

基金:国家自然科学基金(编号:81571007);吉林省科技发展自然科学基金(编号:20180101121JC)