外伤、龋齿与畸形中央尖折断可导致年轻恒牙牙髓坏死及根尖周炎，从而影响牙根的进一步发育[1]。目前此类牙齿状况的治疗方法包括根尖诱导成形术和根尖屏障技术。然而，术后根管壁仍然很薄，术后可能会发生根折，最终导致拔牙[2]。自从Yang等[3]报道了牙髓再生促进牙根延长、根管壁增厚、根尖周病变组织愈合以及牙髓组织重新生成的病例以来，牙髓再生术在基础和临床研究中引起了广泛关注。组织工程(tissue engineering, TE)方法依赖于干细胞、支架和生长因子形成的三维结构的相互作用。目前的牙髓再生术结合了TE原理，用于干细胞递送载体的血凝块中的纤维蛋白网可被视为支架[4]。临床中，由于根尖周炎症的持续时间长、感染范围广和儿童的身体抵抗力等多种原因，导致刺激根尖组织产生的血液量不足，此时无法使用自凝血块(blood clot, BC)作为支架。此种情形促使口腔医生寻找其他的三维支架，如血小板浓缩物[5]等作为BC的替代品。

资料证明，血液离心时血小板会释放大量的生长因子[6]。富含血小板的血浆(platelet-rich plasma, PRP)是第一代浓缩血小板产品，生长因子在离心7～14 h内迅速释放，随后减少[7]。当离心速度增加，生长因子释放更慢时，产生第二代血小板浓缩物[8]富含血小板的纤维蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)。尽管PRP和PRF已成为牙髓再生术的有用支架，并显示出良好的临床和放射学结果，但它们并不优于BC,第三代浓缩血小板(concentrated growth factor, CGF)经常用于种植牙中骨和软组织的再生，并取得了优良效果。与PRP和PRF相比，CGF中的生长因子释放得慢得多，CGF含有大量参与细胞分化、增殖和血管生成的生长因子，这些是组织再生所必需的细胞活性成分[8]。细胞和动物实验验证了CGF在牙髓再生术中的潜在作用[9]。然而，它在人类临床牙髓再生中的作用尚未特别清晰。因此，在本研究中，我们使用CGF和BC作为牙髓再生术的支架，再通过临床和放射学检查评估和比较CGF组和BC组的治疗效果。

1、资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为18名健康儿童(12名男童，6名女童)的20颗单根年轻恒牙，年龄7～13岁(平均9.3岁),均来自于2019年1月至2020年12月在徐州医科大学附属口腔医院儿童口腔科门诊就诊的患者。本研究获得了患者父母的知情同意，项目经徐州医科大学附属口腔医院伦理委员会批准(编号：2019-001)。

1.2 纳入标准

①牙髓坏死伴根尖发育不成熟的牙齿。②不需要为桩/核、最终修复体留出牙髓空间。③患者/家长依从性好。④患者对完成治疗所需的药物和抗生素不过敏(患者术前身体状况评估分级Ⅰ或Ⅱ级)。

知情同意：①两次(或更多)就诊。②使用抗生素。可能出现的不良反应：冠/根变色、治疗无效、疼痛/感染。③替代治疗：三氧矿物聚合物(mineral trioxide aggregate, MTA)根尖成形术、不治疗、拔除(患牙无法挽救)。

排除标准：不符合上述纳入标准的患者被排除在研究之外。

1.3 分组

分组采用计算机生成的随机数表法。患者、研究者和评估者对分配顺序均不知情。

1.4 治疗程序

牙髓再生的治疗程序是根据美国牙髓病医师协会2013年[10]的“Regenerative Endodontic Procedures(REPs)注意事项”进行的。在局部麻醉(2%利多卡因和1∶100 000肾上腺素)下，橡皮障隔离牙齿，用球形金刚钻开髓，根管无需机械预备，采用20 mL 1.5%次氯酸钠+生理盐水交替冲洗进行化学预备，用无菌纸尖干燥根管，然后在釉牙骨质界(cement enamel junction, CEJ)上方根管内壁涂布牙本质粘合剂以防牙冠术后变色。接下来，在显微镜下将含有甲硝唑(山东齐都，中国)、环丙沙星(重庆科瑞制药，中国)和米诺环素(瀚晖制药有限公司，中国)(按照1∶1∶1组合)的三联抗生素糊剂放入CEJ下方的根管中，然后用临时修复材料Caviton暂封。

患者3周后复诊，局部麻醉后，橡皮障隔离，用17%EDTA溶液冲洗去除抗生素糊剂，并用无菌纸尖干燥根管。如果有持续的感染症状，则重复冲洗和用药，直到症状完全消失。如果没有感染迹象，在BC组中，将无菌35号K锉置于根尖孔以外的区域，以刺激根尖出血。在血液回充根管至CEJ下方3 mm后，轻轻放置无菌湿润棉球并停留15 min以在根管中形成血凝块。

在CGF组中，采集每位患者的静脉血9 mL到试管中，立即放入Medifuge(Silfradent, 意大利)离心加速器中，不发生任何振动离心13 min后，将血液分为3层：顶部血清层、中间纤维蛋白层及包含红细胞和血小板的底层。用无菌剪刀取出富含CGF的中间层剪成条索状，再用无菌镊子将CGF碎片放入管腔，并使用无菌垂直加压器将之加压至CEJ下方3 mm。最后，在管腔内用光固化护髓垫底材料(TheraCal)LC(Bisco Inc.,美国)覆盖于CGF支架上固化，厚度2 mm, 玻璃离子垫底，并用Filtek Z350(3M ESPE,St Paul, MN, 美国)填充。

1.5 临床和影像学检查

患者在术后3、6、12、18和24个月复诊，临床检查及牙髓活力测试由同一名未进行牙髓再生术的儿童牙科医生进行，根尖片拍摄采用平行投照技术在医院放射科由同一名工作人员进行，考虑到辐射剂量，CBCT扫描仅在术前首诊及术后24个月进行。对影像学资料的分析由两名没有参与临床治疗流程的经验丰富的儿童牙科医生进行，他们测量牙根长度、根管壁厚度和新增钙化组织的体积。根据AAE“REPs注意事项”中概述的成功目标评估两组的成功率，3种成功目标的描述如下：①一级目标指症状消除，产生骨愈合；②二级目标指根管壁厚度和(或)牙根长度增加；③三级目标指牙髓活力测试反应阳性(如果实现，可能表明形成了有活力的牙髓组织)。

1.6 CBCT扫描和数据测量

由放射科的同一名医生使用CBCT(NewTom VGi, 意大利)对患者进行扫描。所有扫描均在同样参数下进行：110 kV、1～32 mA(平均值：10 mA)、19 s和0.1 mm体素。扫描后获得的图像文件通过附带的NNT软件进行分析，重建层厚为0.3 mm。手动确定牙长轴，使用NNT软件打开CBCT文件，以DICOM格式保存，然后导入mimics软件。依次从冠状面、矢状面和轴向平面手动调整坐标轴，直到确定牙体长轴(图1a)。

牙根长度：以冠状面的CEJ为起点确定平面L。确定L后，可以调整冠状面厚度，找到从根尖到平面最远的位置点A,并确定A到平面L的垂直距离作为牙根长度(图1b)。牙根延长=术后牙根长度-术前牙根长度。

根管壁厚度：从L平面到根长三分之二处确定平面Z,在此平面的轴向确定根管壁的外径(w)和内径(q)。根管壁厚度(e)为外径减去内径(e=w-q)(图1c)。根管壁增厚=术后根管壁厚度-术前根管壁厚度。重建术前和术后的牙根硬组织模型，截取CEJ以下的牙根硬组织以比较体积的变化(图1 d)。新形成的钙化组织体积(CTV)=(术后牙根硬组织体积-术前牙根硬组织体积)。

图1新形成的钙化组织测量方法

1.7 Kappa一致性检验

Kappa统计表明测量者内部和测量者之间有很好的一致性(Kappa值分别为0.82和0.91)。

1.8 统计学分析

使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料若符合正态分布，采用

表示，组间差异比较采用方差分析，P<0.05为差异有显著性。本研究旨在评价和比较CGF和BC作为支架在牙髓再生术中疗效的差异，依据主要结局指标钙化组织体积，采用PASS15.0软件，依据前期观察结果显示两组钙化组织体积在两组均数间的差异约为22mm3,两组共同标准差约为15mm3。设定假设检验的Ⅰ类错误α为0.05,采用双侧检验，Ⅱ类错误β为0.2,两组样本量之比为1∶1,计算得到两组最低样本量分别为9颗牙，设数据缺失率为10%,最终每组样本量为10颗牙，一共20颗。

样本量计算公式：

2、结果

2.1 患者一般信息比较

CGF组和BC组之间的年龄和性别没有统计学上的显著差异(P=0.117;P=0.686)。

2.2 术后临床检查结果

术后疼痛、肿胀和窦道完全消失。初期复诊中患牙的临床检查均正常，最后一次复诊检查发现1例CGF组患者在叩诊和触诊时出现不适，BC组均正常，所有病例均未出现牙冠变色。CGF组和BC组分别有4例和6例患者在术后复诊出现牙髓活力测试阳性。结果如表1所示。

2.3 影像学结果

牙髓再生代表性案例图像见图2。CBCT图像显示CGF组中1例虽根尖孔形成，但表现出根尖区暗影。BC组有3例出现根管闭塞，CGF组未见(图3)。术后所有牙的根长和根管壁厚度均有不同程度的增加。CGF组的根长增加了(1.68±0.9)mm, BC组增加了(2.36±1.34)mm。CGF组根管壁厚度增加(0.44±0.34)mm, BC组增加(0.50±0.31)mm。CGF组和BC组之间的牙根延长和根管壁增厚没有统计学上的显著差异(P=0.201;P=0.671)(图4a)。两组均发现新形成的钙化组织，但CGF组的新形成钙化组织体积(22.13±19.12)mm3明显少于BC组(42.97±22.69)mm3(P=0.039,图4b)。

图2牙髓再生代表性案例

图3根管闭合的CBCT图像

图4实验数据的定量分析

2.4 综合评价

根据美国牙髓病学会(AAE)的“REPs注意事项”中描述的成功目标。CGF组90%的病例达到了一级和二级目标，BC组100%的病例实现了一级、二级目标(P=1.000)。CGF组中40%的病例、BC组中60%的病例达到了三级目标(P=0.656)。

3、讨论

BC作为REPs的支架在一些研究中取得了良好的效果[10]。近年来出现各种血小板浓缩物如PRP和PRF,并且已被证实为REPs的可能支架，并显示出良好的临床和影像学结果。Zhu等[11]将羟基磷灰石/胶原(nano-hydroxyapatite/collagen composite, nHAC)和CGF联合修复兔下颌骨缺损，将nHAC/CGF和nHAC植入兔下颌骨，分别进行X线、Micro-CT、免疫组织化学染色及生物力学测试。结果表明，随着材料的降解，nHAC/CGF组的新骨形成率明显高于单纯nHAC组。然而作为第三代血小板浓缩液，CGF作为REPs支架在临床患者中的作用尚不十分清晰，因此，本研究对CGF和BC作为支架在REPs中的治疗效果进行了评估和比较。结果表明，CGF作为支架在根尖周病变的愈合和牙根形成方面取得了与BC组相当的效果，CGF组的成功率略低于BC组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

所有患牙首诊时均为年轻恒牙，早期复诊时所有牙的临床表现均正常，术后24个月复诊时，CGF组有1例出现临床检查触诊、叩诊不适，影像学检查发现根尖区域暗影，但根尖闭合，且牙根长度和根管壁厚度均有增加，该病例被判断为失败病例，后期进行了根管治疗。有研究也报告称REPs后出现了再次感染，且发生在牙根发育完成后。他们认为创伤和根管消毒不彻底是不再次感染的原因[12]。在本研究中这例CGF病例的再次感染，研究人员推测可能是由于咀嚼强度较大引起的修复体渗漏。

目前牙髓“再生”最常见的临床方法是采用BC作为支架实现的[13]。一些学者认为BC在组织愈合的初始阶段发挥作用是有颗粒状组织形成[14]。其他报告表明，被刺激出的血液可以将干细胞和生长因子从根尖区域带入根管，这可以促进牙根发育[15]。然而，另一些研究表明，BC的形成是不可靠的，因为血凝块中的生长因子和细胞成分是不可预测的[16]。在本研究中，BC组的X线片显示根尖区暗影消失，证实了组织愈合的发生。同时，牙根长度和根管壁厚度均显著增加，有些牙甚至在牙髓活力测试中显示出阳性反应。所有这些结果都证实了使用BC作为支架的REPs在治疗患有牙髓坏死或根尖周炎的未成熟恒牙方面是非常有效的。

在CGF组中，在根管中放置CGF之前仅仅进行了引血。因此，治疗后出现的根尖周组织愈合、根尖孔形成、根长和根管壁厚度增加、钙化组织的形成以及出现牙髓活力主要归因于CGF参与了根管微环境，CGF组与BC组在根延长和根管壁增厚方面无统计学差异(P=0.201;P=0.279)。之前的研究报道显示CGF含有大量的生长因子，这些生长因子参与了骨和软组织再生的基本细胞活动，包括细胞分化、增殖和血管生成[17]。同样，本研究的结果表明CGF组和BC组均形成新的钙化组织，但CGF组新形成的钙化组织的体积((22.13±19.12)mm3)小于BC组((42.97±22.69)mm3)(P=0.039)。这可能与①CGF中存在促炎细胞因子例如白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)和白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)对组织修复和再生产生负面影响[18]。②根尖坏死的程度以及个体免疫调节差异有关[19]。此外，REPs治疗后愈合过程相对较长，为术后18个月至5年。而本研究的术后观察时间最长为24个月，相对较短，还需要更多随访数据反映两组治疗效果。

有学者提出根管闭塞是牙髓再生愈合的结果之一，在一些REPs病例中已经报道了不同程度的根管闭塞[20]。Meilerska等[21]将根管闭塞描述为牙髓再生术后根管腔内异位的骨和牙骨质形成，因为术中从根尖区诱导出血，而根尖周血液中会携带牙周膜干细胞和骨髓干细胞，它们具有牙骨质形成和成骨分化能力。在研究中我们也发现BC组有3例根管明显闭合，而CGF组没有。根管钙化的形式可能在整个管内扩散，也有仅在根尖部引起的闭塞(图3)。因此我们假设BC组来自于根尖血液的干细胞比CGF组多，但这一假设需要进一步验证。

MTA置入后牙冠变色是常见现象[22],含有米诺环素的三联抗生素糊剂也可能导致牙齿变色。但本项研究中没有1例患牙出现变色，因为本研究使用牙本质粘结剂[23]封闭了CEJ上方的牙本质壁，并使用Theracal LC代替MTA,并避免了前两种引起牙冠变色的因素。近期的研究中，Theracal LC在直接盖髓后显示出可靠的临床结果，并且将质量分数为10.0%的酸性单体掺入Theracal LC增强了其与牙本质的结合，且不会对材料的机械性能和离子浸出能力产生负面影响。

基金资助:江苏省徐州市科技支撑项目(KC19132,KC17127); 江苏省徐州市卫生健康委员会面上项目(XWKYSL20210200,XWKYHT20230042); 徐州市彭城英才医学青年后备人才培养项目(XWRCHT20220033);

文章来源:谢妮娜,魏路明,袁长永,等.浓缩生长因子和血凝块作为支架在牙髓再生术中的疗效比较研究[J].口腔医学,2024,44(09):678-684.