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氧化石墨烯气凝胶促进兔骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

2024-02-23 40 上传者：管理员

摘要：目的:研究氧化石墨烯(graphene oxide, GO)气凝胶对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法:组织块法培养新西兰大白兔下颌骨圆形骨片获得细胞，免疫荧光检测干细胞标记物CD44以及BMSCs标记物CD90表达。将培养所得细胞分别接种于96孔板、明胶海绵(gelatin sponge, GS)、GO气凝胶支架，通过CCK-8检测接种第1～3天96孔板(空白组)、GS组、GO组细胞OD值。经成骨诱导7 d后，细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测。制备新西兰大白兔双侧下颌骨颊侧骨壁圆形骨缺损模型，分成空白组(单纯使缺损区内血液充盈)、骨粉组(缺损区充填Bio-Oss骨粉)、支架组(缺损区充填GO气凝胶支架)。于3个月后，X线片及CBCT观察3组缺损区骨生成情况，制备组织切片经HE染色后进行组织学观察。结果:组织块法培养所得第3代细胞CD44和CD90均阳性，证实为BMSCs。GO支架和GS支架均可促进BMSCs增殖、向成骨细胞分化，且GO支架优于GS支架。动物实验结果显示，GO支架与骨粉组缺损区域的成骨效果均优于空白组，GO支架的成骨效果优于骨粉组。HE染色结果显示，GO支架组和骨粉组新生骨均能与缺损区边缘相连续，而GO支架对骨缺损边缘修复的效果更佳。结论:GO气凝胶可促进BMSCs的增殖和向成骨分化，能够促进骨缺损区新骨生成，是较好的组织工程支架材料。

关键词：
成骨
氧化石墨烯
组织工程
细胞支架
骨髓间充质干细胞
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组织工程学也被称为“再生医学”,是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。组织工程的三大要素，即种子细胞(seed cell, SC)、负载细胞生长的支架以及相关诱导因子或生长因子[1,2]。许多研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有成骨分化和成脂分化的能力[3],其中向成骨细胞分化能力尤为突出，能够作为组织工程中的种子细胞[4,5,6,7]。氧化石墨烯(GO)相具有良好的亲水性和表面活性，在载药、基因传递、生物成像以及组织工程中均有广泛的应用[8,9,10]。目前，利用石墨烯改善支架材料的生物学特性促进间充质干细胞或成骨细胞黏附、增殖和成骨分化的能力已在研究中得到证实[11]。但采用GO气凝胶作为组织工程支架材料的效果尚有待于进一步研究。本研究将GO气凝胶作为组织工程支架材料，研究其对兔BMSCs细胞增殖及成骨分化的影响，并观测GO气凝胶作为人工骨替代材料于动物体内的成骨效果，以期为GO气凝胶作为骨组织工程支架材料应用于再生医学提供基础依据。

1、材料和方法

1实验材料

氧化石墨烯气凝胶支架来自厦门大学；明胶海绵支架(上海医疗);α-MEM培养液、胎牛血清、成骨诱导液(iCell-MSCYD-002;Gibco,美国);青霉素链霉素双抗、水合氯醛、细胞冻存液、Triton X-100(索莱宝科技，中国);25%胰蛋白酶溶液(Invitrogen,美国);Dispase酶、Ⅰ型胶原酶(Sigma,美国);CCK-8试剂盒(北京吉美生物);ALP检测试剂盒(上海康朗生物);Anti-CD44、Anti-CD90(abcam,英国);Bio-Oss骨粉、生物膜(盖世制药公司，瑞士)。

2 BMSCs的分离、培养与鉴定

取12～16周龄的健康SPF级健康新西兰大白兔2只(雄性1只、雌性1只),利用种植动力系统及环形取骨钻取得下颌骨圆形骨片2片，每片直径约5 mm,采用组织块法培养细胞，在含有青、链霉素和20%胎牛血清的α-MEM培养基中进行。取生长状态良好的第3代BMSCs制作细胞爬片，利用经1:500稀释的Anti-CD44抗体(抗兔，abcam, ab157107)以及Anti-CD90抗体(抗兔，abcam, ab225)进行免疫荧光鉴定，在荧光显微镜下观察并采集图像。

3细胞分组培养

空白组：单纯将BMSCs细胞接种于96孔板小孔；GS组：将BMSCs细胞接种于明胶海绵(GS)支架；GO组：将BMSCs细胞接种于GO气凝胶支架。将96孔板置于37℃、5%CO2细胞浮箱中，24 h待细胞贴壁或附着于支架后，更换新鲜培养液，以后每1 d更换1次新鲜培养液。

4细胞学检测

利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)进行细胞增殖检测，细胞接种24 h后将96孔板分组并划线标记，第1、3、5天分别各组加入10μL CCK-8试剂，继续培养1 h后，弃去培养液后加入新液利用酶标仪测定450 nm处的吸光度(optical density, OD)。利用ALP进行活性检测，取生长状态良好的第3代BMSCs制成细胞悬液，分组接种于GS气凝胶支架、GO支架及96孔板小孔中，并加入成骨诱导液，7 d后参照ALP试剂盒说明书检测其活性。

5体内成骨实验

SPF级健康新西兰大白兔购自北京实验动物研究中心。取12～16周龄的健康SPF级新西兰大白兔12只(雄性6只、雌性6只),称重后麻醉，于双侧下颌骨颊侧骨壁制备圆形骨缺损模型。空白组：使缺损区内血液充盈，不做其他处理；骨粉组：缺损区充填Bio-Oss骨粉，生物膜覆盖于缺损区；支架组：缺损区充填GO气凝胶支架，生物膜覆盖于缺损区。术后每只实验兔给予五水头孢(粉剂)1支(0.5 g,深圳华润九新药业)配液后腹腔注射，待苏醒后观察其创口情况及活动、进食等是否正常。于3个月后处死，将下颌骨完整分离，观察骨缺损边缘是否有新骨形成，与正常骨组织是否连续。影像学检查：取分离后的下颌骨，拍摄X线牙片及锥形束CT(CBCT)影像，观察各组骨缺损区的修复情况，CBCT测量骨密度：使用锥形束CT机(KaVo 3D eXam,德国)对兔下颌骨体进行完整投照，选取各组骨缺损区近远中向中间位置片层，使用“HU统计”功能，测量术区骨密度(单位：HU)。组织学观察：术后3个月，将缺损区及其周边骨组织包埋后制作组织切片，HE染色观察骨缺损区成骨情况。

6统计学分析

数据采用SPSS 17.0软件分析，所有实验均独立重复3次，数据采用均数±标准差

表示，两独立样本间比较采用独立样本t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

1兔间充质干细胞培养及鉴定

取兔下颌骨骨片，于培养皿培养7 d后，可见骨片边缘有少量细胞贴壁生长，细胞分布不规整，距骨片边缘近处细胞较密集，稍远处细胞较为稀疏，细胞形态稍不规则，多呈梭形、三角形或多边形(图1A)。约2～3 d后，可见骨片边缘区域细胞可达80%或以上。传至第3代后细胞呈长梭形，分布较原代细胞均匀、整齐(图1B)。免疫荧光染色结果显示，培养所得细胞均表达干细胞抗原标记物CD44(图1C)和BMSCs标记物CD90(图1D)。因此，从形态和细胞表面标记物表达情况可证实培养所得细胞为BMSCs。

图1兔下颌骨间充质干细胞培养基鉴定

2 GS和GO均增强兔BMSCs增殖能力和ALP活性

CCK-8法检测BMSCs细胞活力结果显示，第1天GS组、GO组和空白组间OD值无显著差异(P>0.05);第3天、第5天，GO组、GS组OD值均显著高于空白组(P<0.05),而GO组和GS组间OD值无显著性差异(P>0.05)(图2A)。GO气凝胶支架具有与GS支架相似的促进BMSCs增殖的效果。经成骨诱导7 d后各组BMSCs ALP活性显示，GO组OD值显著高于GS组(P<0.05);GS组与空白组OD值无显著差异(P>0.05)(图2B)。与GS支架相比GO气凝胶支架促进BMSCs成骨分化的效果更佳。

图2明胶海绵和氧化石墨烯对兔BMSCs增殖和ALP活性的影响

3 GS和GO均增强兔BMSCs体内成骨能力

各组手术分离下颌骨，可见支架材料在位无脱落。空白组骨缺损区表面未见明显新生骨组织；骨粉组骨缺损区表面边缘尚可见，有新骨形成，部分新生骨与正常骨组织相连续；支架组骨缺损区表面边缘不明显，一半以上被较为平整的新生骨组织覆盖，与周围骨组织相似且连续(图3A)。X线片所示(图3B),空白组于缺损区可见大面积透射影像，未见明显新骨生成，缺损区边缘可见少量骨吸收；骨粉组于缺损区可见充填物中有新骨生成，大部分呈颗粒状阻射影，但充填物与骨缺损边缘未融合处尚可见骨缺损边缘较清晰；支架组于缺损区可见充填物中有新骨生成，大部分呈交织状阻射影，充填物多数边缘与骨缺损边缘相融合。骨粉组和支架组相对骨密度均显著高于空白组(P<0.05,P<0.01),支架组显著高于骨粉组(P<0.05)。CBCT影像(图3C)显示，空白组骨缺损区内未见明显新骨形成，骨粉组可见骨缺损区内有部分新骨形成，支架组可见缺损区内有较多新骨形成，且生成新骨与原有骨质连接紧密。骨粉组和支架组缺损区相对长度均显著低于空白组(P<0.05,P<0.01),且支架组缺损区长度显著低于骨粉组(P<0.05)。结果表明GO气凝胶支架与Bio-Oss骨粉成骨效果均优于不植入骨代替材料，GO气凝胶支架相比Bio-Oss骨粉具有更好的成骨效果。

HE染色显示空白组骨缺损区可见稀疏的类成纤维细胞相互连接成网状，边缘区可见细胞与正常骨组织相连，有少量纤维样骨组织形成；骨粉组骨缺损区可见较多新骨生成，部分骨粉边缘与正常骨组织相连，分界处可见层状新生骨结构；支架组骨缺损区可见大量新骨生成，新生骨与GO气凝胶支架层层重叠，相互交织，紧邻支架区域偶见染色较深的新生骨，支架较多边缘与正常骨组织紧密相连，分界处层状新生骨形成较为密集，形成新骨染色较为均匀(图3D)。结果表明骨缺损区植入Bio-Oss骨粉与GO支架生成的新生骨均能与缺损区边缘相连续，而GO支架对骨缺损边缘修复效果更佳。

图3体内成骨实验CBCT影像及HE染色结果

3、讨论

骨缺损修复的理想干细胞应有着易于获取，获取时创伤较小，细胞能通过体外培养迅速扩增等优点。此外，细胞在宿主骨组织内的存活、增殖及分化状态良好，细胞经培养扩增后不显示出肿瘤细胞的性质。本实验采用兔BMSCs进行组织工程学实验，研究组织工程材料支架的相关性质及成骨效果。研究表明，骨髓、内皮细胞和血管周围细胞在骨骼修复中都极为重要，而骨髓是干细胞最重要的来源[12]。骨膜是间充质干细胞的另一个来源，有研究在小鼠的骨折模型中，于新骨形成区域的骨内伤愈组织内发现了BMSCs的存在[13,14]。然而，骨膜中来源的BMSC获取相当困难。相比之下，血管生成对骨折的修复显得尤为重要[15]。BMSCs向成骨细胞分化的机制非常复杂，许多研究都在试图证明这一过程的潜在机制。研究表明，该过程涉及多种信号分子，包括TGF-β、BMP、Notch、Wnt、Hedgehog和FGF等。众多细胞因子通过错综复杂的机制，相互作用，最终可促进BMSCs的成骨分化[16]。尽管BMSCs向成骨细胞分化的机制尚不完全明确，但其成骨分化的能力已经被许多学者证实，表明其非常合适作为骨组织工程中的种子细胞。

石墨烯的特殊性质及其潜在的不同应用导致了组织工程支架材料中复合材料的飞速发展，其中包括单层石墨烯(few-layer grapheme, FLG)、超薄石墨(ultrathin graphite, UG)、GO、还原型氧化石墨烯(reduced graphene oxide, rGO)和石墨烯纳米片(graphene nanosheets, GNS)等，其中包括一系列“石墨烯族纳米材料”(graphene-family nanomaterials, GFN)[17,18]。其中如GO基质等，已经被证明能够刺激人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)分化为脂肪细胞[17],或诱导神经干细胞(neural stem cells, NSC)分化为3D多孔结构的神经元[19]。也有研究指出，石墨烯支架可能是诱导hMSCs成骨分化的重要基质[20]。利用石墨烯改善支架材料的生物学特性，其促进干细胞或成骨细胞黏附、增殖和成骨分化的能力已在研究中得到证实[11]。石墨烯作为一种具有生物相容性表面的涂层材料，已被证明是一种可促进干细胞向成骨前体细胞和成骨细胞分化的安全模型[20]。Crowder等[21]研究证实了MSCs在石墨烯基质上的成骨分化潜能，特别是3D石墨烯结构在诱导成骨分化中的效果比较突出。其所使用的泡沫形状结构特别适合作为基质诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞。

已有研究指出，石墨烯及其相关材料能够诱导人类干细胞分化为特定的谱系，与传统的基质或支架[8,19,21,22,23,24]相比，涂有石墨烯或GO或3D石墨烯泡沫的材料能够保证生存能力并诱导干细胞的成骨分化。在神经元再生方面，石墨烯和GO表现出相同的分化潜能。凭借石墨烯材料的结构和功能，可以很好地在体外模拟细胞外基质结构[19]。除了成骨和神经细胞分化外，GO还可以控制脂肪生成[8,19]。相信随着石墨烯材料在组织工程中研究的深入，最终将为临床再生医学打开新的篇章。综上所述，本研究通过体外实验证实GO气凝胶作为组织工程支架材料有助于兔BMSCs增殖及向成骨分化，且成骨分化效果优于GS支架。体内成骨实验证实GO气凝胶支架能够促进骨缺损区新骨生成，且效果优于Bio-Oss骨粉。

基金资助:河北省医学科学研究课题计划项目(编号:20240104);

文章来源:杨莹,李玉凤,李林峰等.氧化石墨烯气凝胶促进兔骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化[J].临床口腔医学杂志,2024,40(02):75-79.