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RANKL/RANK/OPG信号通路对双硫死亡影响机制研究

2025-04-07 89 上传者：管理员

摘要：双硫死亡是二硫键应激引发的一种由于二硫键细胞内积累导致肌动蛋白细胞骨架崩溃,导致细胞死亡的新型细胞死亡形式｡研究发现双硫死亡与RANKL/RANK/OPG信号通路密切相关,但其具体机制尚未明确｡笔者以RANKL/RANK/OPG信号通路对双硫死亡的发生机制的影响进行阐述,对其关系进行总结,为防治骨代谢相关疾病提供新途径｡

关键词：
NFATc1
RANKL/RANK/OPG信号通路
SLC7A11
低葡萄糖
双硫死亡
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1、双硫死亡概述

双硫死亡于2023年由甘波谊等提出[1],研究发现在低葡萄糖状态下,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)供应不足,癌细胞内高表达的胱氨酸转运体溶质载体家族7成员11( SLC7A11)会使肌动蛋白细胞骨架受到细胞内胱氨酸过度积累引起的二硫键应激,进而肌动蛋白细胞骨架蛋白之间存在异常二硫键,导致细胞死亡｡其中胱氨酸积累和F⁃肌动蛋白收缩是双硫死亡的标志｡

1. 1硫在细胞中的的代谢

硫( S)是一种多价非金属化学元素,人体平均(70 kg)含有约140 g硫,尤其是硫醇化合物,其在新陈代谢中起着关键作用[2]｡同时,硫是所有生命形式的必需营养素,多存在于初级和次级代谢的大量代谢物中,主要存在于半胱氨酸､蛋氨酸以及铁硫簇､硫辛酸和辅酶A等辅助因子中,也是蛋白质､碳水化合物和许多细胞代谢物中硫酸酯的成分[3]｡在这些大多数代谢物中,硫以有机硫醇形式存在[4]｡其中半胱氨酸是动物和人体中硫的主要来源,是关键的含硫化合物,也被认为是硫同化的终末代谢产物,也是蛋氨酸､谷胱甘肽和各种其他硫代谢物的生产起点[5]｡

1. 2双硫死亡的调控机制

当细胞中磷酸戊糖途径(PPP)受抑制时会导致NADPH缺乏,氧化还原被抑制,进而导致胱氨酸细胞中异常积累｡胱氨酸异常积累和NADPH缺乏共同导致细胞内异常二硫化物累积,进而导致二硫键应激｡这种应激导致F⁃肌动蛋白内形成许多二硫键,使F⁃肌动蛋白收缩并脱离细胞膜,最终造成细胞死亡｡故细胞内NADPH产生不足､胱氨酸等二硫化物的过度积累以及SLC7A11的表达升高,都与双硫死亡密切相关｡

1. 3 NADPH氧化还原抑制

双硫死亡氧化还原稳态对细胞生命至关重要｡NADPH的氧化还原为胱氨酸提供了关键的还原能力,以抑制二硫化物应激并维持细胞存活｡NADPH是PPP代谢的产物之一,低葡萄糖状态会减少NADPH的含量｡由于癌细胞的异常表达,使胱氨酸发生积累､导致胱氨酸还原为半胱氨酸会大量消耗NADPH,若NADPH供应短缺会迅速耗尽NADPH,导致细胞内二硫键分子的大量积累进而导致细胞快速死亡[6],当细胞内NADPH的产生不足或过量消耗时,细胞内的氧化还原稳态被破坏[7],这种破坏导致肌动蛋白细胞骨架中二硫化物的过度积累,造成双硫死亡的发生｡

1. 4 SLC7A11的表达调控

SLC7A11转运蛋白是溶质载体(SLC)家族的成员,在维持细胞内谷胱甘肽水平和保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡方面发挥着关键作用[8],它对胱氨酸⁃谷氨酸转运系统至关重要,胱氨酸转运系统由两个通过二硫键连接的亚基组成,包括重链亚基溶质载体家族3成员2( SLC3A2)和SLC7A11 ,SLC7A11是一种钠非依赖性反转运蛋白,以1∶1的比例输出细胞内谷氨酸并输入细胞外胱氨酸[9],SLC7A11是一种多通道跨膜蛋白,调控细胞中的胱氨酸､谷氨酸反转运蛋白活性[10]｡而SLC3A2是一种单一的跨膜蛋白,是维持SLC7A11蛋白稳定性和适当膜定位的伴侣[11]｡由于SLC3A2还作为其他几种氨基酸转运蛋白的伴侣,其功能不仅仅限于胱氨酸转运[12]｡Mou等[13]研究表明,SLC7A11在保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡(例如铁死亡)方面具有很好的作用,并且在许多人类癌细胞中过表达｡SLC7A11的表达与转录因子､表观遗传调节因子､蛋白质稳定性､和其他蛋白质的相互作用､转录后调控､翻译后调控和转运蛋白活性有关[14]｡已确定两种转录因子,即核因子红细胞系2相关因子2(NRF2)和激活转录因子4(ATF4),可调节应激诱导的SLC7A11转录[15]｡研究发现,在细胞应激条件下,NRF2的蛋白酶体降解受损,导致其稳定和易位到细胞核｡在细胞核中,NRF2与基因启动子区域中存在的抗氧化反应元件(ARE)结合,并调节包括SLC7A11在内的几种抗氧化反应相关靶基因的转录[16]｡ATF4mRNA的翻译在细胞应激条件下增强,应激(包括氨基酸剥夺)导致磷酸化的真核翻译起始因子2α( eIF2α)抑制许多mRNA的翻译[17],包括ATF4,释放ATF4翻译并增加ATF4蛋白的产生｡ATF4进一步结合SLC7A11等基因启动子区域中的氨基酸反应元件(AARE),使细胞能够适应和响应应激[18]｡例如,在胱氨酸饥饿条件下,胰腺癌细胞上调SLC7A11表达作为应激反应[19]｡在这些条件下,NRF2和ATF4相互作用并协同调节SLC7A11表达｡与NRF2和ATF4相比,p53已被证明可抑制SLC7A11表达,但其机制尚不清楚[20]｡最近,NRF2和ATF4缺乏症被证明可以降低SLC7A11水平,从而提高癌细胞在低血糖条件下的存活率｡NRF2或ATF4缺陷细胞中SLC7A11的恢复使它们对葡萄糖饥饿重新敏感｡同样,癌细胞中的NRF2激活导致对谷氨酰胺饥饿和谷氨酰胺酶抑制的敏感性增加,这可能是由于SLC7A11介导的谷氨酸输出增加[21]｡除了在细胞应激条件下对SLC7A11进行转录调控外,SLC7A11还通过转录后机制进行调控[22],与其他蛋白质的相互作用和翻译后修饰也会影响SLC7A11的表达和活性,需要SLC3A2来维持SLC7A11稳定性[23]｡CD44变体(CD44v)亚型与癌细胞相互作用并稳定癌细胞中的SLC7A11｡CD44v可维持SLC7A11蛋白稳定性,而CD44v缺损会损害SLC7A11的细胞表面定位,从而导致ROS诱导和抑制肿瘤形成[24]｡最近研究表明,SLC7A11转录的表观遗传调控在控制双硫死亡中起着关键作用,研究发现,细胞中高表达溶质载体家族7成员11( SLC7A11)会导致胱氨酸摄取率提高[25],在SLC7A11高表达的细胞中,葡萄糖低水平时细胞中会发生胱氨酸和其他二硫化物的异常积累,诱导二硫键应激,增加肌动蛋白细胞骨架中二硫键的含量,导致肌动蛋白丝收缩､细胞骨架结构破坏和细胞死亡[26]｡二硫化物积累的原因包括SLC7A11高表达导致的胱氨酸摄入过多以及细胞中胱氨酸还原的阻塞｡

1. 5胱氨酸异常积累是双硫死亡的标志

胱氨酸作为双硫死亡最主要的二硫化物,其在体内异常积累就会促进双硫死亡的发生,受到NADPH的氧化还原转化为半胱氨酸,半胱氨酸是一种蛋白氨基酸,在蛋白质合成､翻译后修饰和氧化还原维持中具有多功能作用,通过提供合成谷胱甘肽(GSH)和其他参与抗氧化防御的生物分子的限速前体,在维持细胞氧化还原稳态方面起着关键作用[27]｡在转移性癌细胞,经常经历高水平的氧化应激,因此对细胞外空间的半胱氨酸有很高的需求[28],以建立它们的抗氧化防御系统[29]｡然而,由于氧化的细胞外环境,细胞外半胱氨酸不稳定并迅速转化为胱氨酸,半胱氨酸的氧化二聚体形式,其在细胞外空间中的浓度通常比半胱氨酸高一个数量级[30]｡因此,大多数癌细胞主要依靠胱氨酸转运蛋白SLC7A11来输入细胞外胱氨酸,一旦被转运到胞质中,胱氨酸就会被还原为半胱氨酸,随后用于合成GSH以进行抗氧化防御[31]｡

1. 6肌动蛋白细胞骨架与双硫死亡

双硫死亡主要破坏肌动蛋白细胞骨架,肌动蛋白是真核细胞中最丰富的蛋白质之一,也是微丝系统的主要成分｡它在许多细胞活动中起着重要作用,包括肌肉收缩､维持细胞完整性､细胞运动以及转录调控｡肌动蛋白的功能还受翻译后修饰的调节,例如乙酰化､精氨酸化､氧化还原等[32]｡肌动蛋白可以通过多个肌动蛋白丝的协调聚合产生推力,或者通过肌球蛋白丝沿肌球蛋白双极丝滑动产生拉力,这两种力对于全细胞迁移非常重要[33]｡细胞的形状和承载强度由包含肌动蛋白细胞骨架的复杂蛋白质网络决定｡通过接收外部环境的化学信号和机械刺激,肌动蛋白细胞骨架的组织可能会发生动态变化｡从单体(G⁃肌动蛋白)聚合成细丝(F⁃肌动蛋白)的能力对于细胞分裂､细胞运动和环境力感知等生物过程至关重要,从而为细胞运动提供动力[34],但细胞骨架蛋白构象被破坏时,就会发生细胞死亡｡

2、NFATc1通过RANK/ RANKL/ OPG信号通路上调SLC7A11的表达

RANK/ RANKL / OPG信号通路是调控骨稳态的主要信号通路｡Zhong等[35]研究发现,在核因子κB(NF⁃κB)配体受体激活剂(RANKL)介导的破骨细胞生成受体激活时,破骨细胞前体(pre⁃OCs)比骨髓来源的单核细胞(BMDM)更容易受到硫氧蛋白还原酶1 ( TXNRD1 )抑制剂的影响,活化T细胞1(NFATc1)的核因子在RANKL诱导的破骨细胞生成过程中通过转录调控上调SLC7A11的表达｡TXNRD1被抑制后细胞内二硫键还原的速率显著降低｡SLC7A11表达上调使胱氨酸转运加快,使大量胱氨酸过度累积,增加细胞二硫键应激作用后形成肌动蛋白细胞骨架蛋白内的异常二硫化物键,最终导致细胞死亡｡NFATc1是NFAT家族的5个成员之一[36],NFAT信号在各种生理和病理过程中起着广泛作用,大量研究表明,NFATc1对破骨细胞分化和功能起着关键作用｡在RANK激活后,包括TRAF6在内的几种信号转导接头被募集并激活[37]｡衔接子的募集集中在激酶激活上,并促进NFATc1和NF⁃κB的激活,Liang等[38]研究发现RANK介导的细胞内Ca2+动员刺激钙调磷酸酶使NFATc1去磷酸化并诱导NFATc1核易位,RANKL连接RANK导致下游信号通路激活,促进核易位和NFATc1和NF⁃κB的激活,引起破骨细胞分化[39]｡RANK是RANKL的信号受体,是由肿瘤坏死因子受体超家族成员11a(TNFRSF11A)编码的I型膜功能受体,主要由造血干细胞表达,包括破骨细胞及其前体,也可以骨髓间充质干细胞中被检测到[40]｡据研究发现破骨细胞前体上表达的RANK与来自骨细胞和成骨细胞的RANKL连接促进RANK的三聚体化和激活RANK的细胞内结构域具有衔接蛋白TNF受体相关因子( TRAF)的结合位点[41]｡RANK被激活后,信号转导接头(TRAF6)随之激活,促进核易位和NFATc1､c⁃fos和NF⁃κB等因子表达升高｡由含有ITAM基序的蛋白质､DNAX激活蛋白12(DAP12)和Fc受体γ链( FcRγ)介导的共刺激信号与细胞表面受体OSCAR､PIR⁃A或TREM⁃2结合,激活Syk⁃PLCγ通路和钙通量｡钙通量诱发Ca2+依赖性钙调磷酸酶信号,增强NFATc1和转录因子cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的活性,使CREB诱导破骨细胞特异性基因的表达上调[42]｡NF⁃κB可以增加c⁃Fos表达,并与NFATc1相互作用后触发破骨基因转录程序｡因此,这些调节因子能够促使破骨细胞分化､成熟,增加其存活时间,激活破骨细胞的骨吸收能力｡RANKL是破骨细胞发育和骨代谢的关键调节因子[43],可诱导骨吸收｡RANKL与破骨细胞祖细胞表面的受体RANK结合,诱导破骨细胞前体分化为成熟的破骨细胞｡研究发现骨保护素(OPG)和G蛋白偶联受体4( LGR4)均可以与RANKL相互作用,是RANKL⁃RANK通路的内源性抑制剂[44];其次,RANKL还充当RANK的受体,与其结合后通过富含脯氨酸的基序反向激活RANKL信号传导｡RANKL通过RANK可溶性形式选择性剪接表达和基质金属蛋白酶的蛋白水解产生激活RANK信号转导的功能[45]｡RANKL还能通过自分泌⁃旁分泌环作用于RANK､OPG､LGR4等受体促进成骨细胞分化｡因此,通过RANK/ RANKL / OPG信号通路调控RANK､OPG､LGR4等重要调节因子以维持骨稳态｡OPG是一种60 kDa糖蛋白,也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)[46],其表达受成骨细胞因子的调节｡由雌激素､IL⁃4和转化生长因子β ( TGF⁃β )诱导OPG竞争性地结合RANKL[47],干扰RANKL⁃RANK相互作用并阻断骨吸收[48]｡由于OPG结合RANKL后干预RANK⁃RANKL信号传导,抑制破骨细胞前体的成熟和活化,进而抑制破骨细胞骨吸收､促进骨形成[49]｡大量研究证实了RANKL⁃RANK⁃OPG通路在调控骨稳态､免疫系统､炎症､等病理生理条件方面有关键作用[50]｡

3､小结与展望

双硫死亡与RANKL⁃RANK⁃OPG信号通路密切相关,通过激活RANK,破骨细胞随之过度激活,导致NFATc1表达升高,然后NFATc1通过转录翻译上调SLC7A11的表达水平,当SLC7A11的表达升高后,胱氨酸摄取率提高,导致二硫化物在细胞内累积,二硫键应激,进而介导双硫死亡的发生,RANKL⁃RANK⁃OPG信号通路作为维持骨稳态的经典通路,对于骨代谢疾病的发生有着重要的调控作用,经过研究发现,双硫死亡对于骨代谢疾病关系密切,作为近两年来新的研究,对于双硫死亡机制的了解还不够完善,其发生过程受到多因素的调控,因此其确切机制仍需要进一步进行阐明｡然而,目前尚不清楚为什么二硫键应激优先发生在肌动蛋白细胞骨架相关蛋白中,是否还有其他分子参与调控双硫死亡的发生,其他分子是否干预骨代谢疾病的发生,由于双硫死亡是一个全新的领域,若能进一步研究双硫死亡与骨代谢疾病与双硫死亡的关系,揭示其关键信号通路､靶基因和靶蛋白,为骨代谢疾病的治疗提供新思路｡因此通过从基础研究到临床研究的证明是非常具有挑战性｡

基金资助:国家自然科学基金(82160915,81860859);兰州市科技局项目(2022-3-23);

文章来源:马小成,曹林忠,拦玉鑫,等.RANKL/RANK/OPG信号通路对双硫死亡影响机制研究[J].中国骨质疏松杂志,2025,31(04):604-608.