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CK-pan、CK5/6、p63在术中快速诊断中的应用及意义

2024-07-01 278 上传者：管理员

摘要：目的探讨术中快速免疫组化染色在快速冰冻病理诊断过程中的作用。方法选取苏州大学附属第四医院病理科12例快速诊断困难的病例，用直接免疫组化抗体CK-pan、p63、CK5/6对冰冻切片组织进行染色，判读结果与常规石蜡免疫组化染色结果进行比对。结果术中快速免疫组化染色结果与HE镜下表现较为吻合，且与常规石蜡免疫组化染色结果存在较高的一致性。结论术中快速免疫组化染色能很好地辅助病理医生，对冰冻快速镜下难以鉴别肿瘤良恶性、淋巴结转移情况、体内可疑转移灶术中活检的病例做出较为精确的诊断。

关键词：
乳腺乳头状肿瘤
冰冻切片
术中快速免疫组化
淋巴结转移
细支气管腺瘤
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随着诊疗技术的日新月异，临床医生对病理医生的要求进一步提高，其中也包括了术中快速病理诊断的精确性与及时性。由于冰冻制片的限制性与部分病例的特殊性，特别是在肺细支气管腺瘤与肺腺癌的鉴别、乳腺导管增生性病变良恶性的判断、术中活检恶性肿瘤患者的可疑转移灶等，由于冰冻制片后的细胞形态存在压缩和变形，需要明确是否有基底细胞、肌上皮的存在以及诊断为低分化癌时难度更大，导致结果判读及冰冻报告的签发存在极大的挑战性。术中快速免疫组化是近些年较为热门的技术，运用术中快速免疫组化抗体CK-pan、p63、CK5/6等进行染色，可以很好地解决这一难题，协助病理医生更有把握地对冰冻结果进行较为精确的判读。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集苏州大学附属第四医院病理科2022年9月至2023年8月进行术中快速免疫组化辅助诊断的12例样本，包括：腹膜、淋巴结、肺、乳腺和胃。该12例标本均在冰冻HE诊断上存在一定的难度，需术中快速免疫组化进一步辅助。具体见表1。

本研究经苏州大学第四医院医学伦理委员会审核批准(伦第241026号)并经患者签署知情同意。

1.2方法

1.2.1主要试剂

即用型术中快速免疫组化抗体(河南赛诺特生物技术有限公司)鼠抗人p63(克隆号C2C10)、鼠抗人CK5/6(克隆号C6H1/C1C8)和鼠抗人CK-pan(克隆号AE1/AE3)。常规石蜡免疫组化抗体为上海基因科技有限公司浓缩液CK5/6(克隆号EP24&EP67),稀释比例1∶400,即用型鼠抗人CK-pan(克隆号AE1/AE3)和福建迈新生物技术开发有限公司即用型鼠抗人p63(克隆号MX013)。

1.2.2快速免疫使用方法

①冰冻切片机切取5μm的组织，附于黏附级载玻片上后立即置于固定液(10%中性甲醛)中固定1 min,后用PBS(磷酸盐缓冲液pH=7.4)冲洗，免疫组化阻水笔画出范围；②封闭液(0.5%牛血清蛋白)封闭组织20 s,后用流水冲洗；③滴入一抗5 min后用清洗液清洗1 min;④滴入二抗4 min后清洗液清洗1.5 min;⑤DAB滴入2 min,流水冲洗；⑥DAB增强剂滴入30 s,流水冲洗；⑦苏木素染色10 s,流水冲洗；⑧梯度乙醇快速脱水后封片。

常规免疫组化染色为剩余组织脱水、包埋、切片后，经EnVision法，在DAKO全自动免疫组化仪Omnis上进行染色。

1.3结果判读

判读CK-pan时，是否有胞质染色的肿瘤细胞存在；判读p63和CK5/6时，是否有核染色/膜染色的基底细胞存在，最终与常规免疫组化结果作对比。阴性判读为阳性肿瘤细胞<5%,阳性强度分为三级，弱阳：单个细胞阳性5%～24%,中等强度阳性：散在或簇状细胞阳性25%～50%,强阳：弥漫片状阳性>50%。

2、结果

最终判读结果如表2、表3、图1～图12所示。

表1术中免疫组化应用的病例基本资料

表2术中及常规免疫组化结果统计

表3术中快速免疫组化与常规免疫组化染色效果对比

图1术中冰冻切片:腹膜纤维间质中见散在深染细胞,核小,异型性不明显,与炎症细胞鉴别困难HE,×100

图2术中快速免疫组化结果:散在的小细胞CKpan阳性,提示纤维间质中见肿瘤转移En Vision,×100

图3常规免疫组化结果:与术中快速免疫组化结果一致,同样提示纤维脂肪间质中见肿瘤上皮浸润性生长En Vision,×100

图4术中冰冻切片:黏液样背景中漂浮小巢上皮细胞,HE镜下基底细胞不明确,难以鉴别细支气管腺瘤和黏液腺癌HE,×40

图5术中快速免疫组化结果:肿瘤上皮细胞CK5/6示基底细胞阳性,同时内对照为自身正常支气管,提示为细支气管腺瘤En Vision法,×40

图6常规免疫组化结果:上皮细胞示CK5/6基底细胞阳性,与术中快速免疫组化结果一致En Vision法,×40

图7术中冰冻切片:乳腺乳头状肿瘤中,细胞异型性小,区分导管内乳头状瘤与乳头状癌或不典型增生(ADH)困难HE,×100

图8术中快速免疫组化结果:乳头状肿瘤内部CK5/6丢失,巢周基底细胞阳性,提示肿瘤存在非典型或恶性病变En Vision法,×100

图9常规免疫组化结果:乳头状肿瘤内部CK5/6表达与术中冰冻一致,巢周基底细胞表达En Vision法,×100

图10术中冰冻切片乳腺肿瘤实性区域肿瘤细胞高度增生需鉴别旺炽性增生与或导管原位癌HE,×100

图11术中快速免疫组化结果:实性区域CK5/6肿瘤内部表达缺失,巢周基底细胞阳性,表明肿瘤为导管内癌En Vision法,×100

图1 2常规免疫组化结果:实性区域CK5/6肿瘤内部同样表达缺失,巢周基底细胞阳性,与术中免疫结果一致En Vision法,×100

3、讨论

自术中快速免疫组化技术问世以来，各研究报道已不在少数，此类技术已成为快速诊断工作中非常重要的部分，尤其在肺、乳腺及可疑转移灶的术中冰冻病理中的应用最为多见[1,2]。

对于恶性肿瘤的可疑转移病灶及淋巴结活检，由于电刀烧灼、冰冻制片细胞固缩及低分化肿瘤自身特性等因素，冰冻制片后的肿瘤细胞拉长、变形，与部分间皮细胞、淋巴细胞、组织细胞等在镜下难以区分，术中快速免疫组化抗体CK-pan的应用，可以有效的提高快速诊断的准确性，将上皮性恶性肿瘤细胞鉴别出来，从而给到临床医生一个准确、可靠的结果。

细支气管腺瘤(bronchiolar adenoma, BA)是一种相对少见的良性肿瘤，近端型BA可见黏液湖，肿瘤上皮细胞为黏液腺上皮，部分可见纤毛；远端型BA黏液罕见，肿瘤细胞腔面呈立方或柱状，可见纤毛，近端型BA与远端型BA都存在基底细胞[3,4],但在冰冻制片后，由于细胞的挤压、变形，组织和细胞的收缩等因素，基底细胞与腺上皮的双层结构往往难以辨认，腔面的纤毛也相对罕见。近端型BA可见在黏液湖中漂泊的黏液腺上皮，这就导致和分化较好的黏液腺癌鉴别困难；远端型BA中见在纤维间质中生长的腺样结构，因缺乏典型的基底细胞，以致与微浸润性腺癌/浸润性腺癌鉴别困难。所以当术中冰冻遇见此类肿瘤时，病理诊断医生往往很为难，在没有术中快速免疫组化帮助的情况下，最终只能给到手术医生一个相对模糊的诊断，这不利于临床医生和患者家属的沟通和进一步手术方案的制定。

由于在有限的时间与取材数目的限制下，导管上皮增生性病变及乳头状肿瘤的良恶性诊断一直是乳腺术中冰冻存在的难题[5]。不典型导管增生(breast atypical ductal hyperlplasia, ADH),当核出现低级别的形态，在冰冻制片后很难与普通型导管增生(breast usual ductal hyperplasia, UDH)相鉴别，尤其病变较为局限时，冰冻诊断更为困难[6,7,8]。当肿瘤出现硬化性腺病的背景，肿瘤细胞被拉长、变形，增生的细胞镜下较为单一时，也会增加诊断的难度。这些病例中，利用术中快速免疫组化CK5/6、p63能很好地互相鉴别。

乳腺乳头状肿瘤包括：导管内乳头状瘤、导管内乳头状癌、实性乳头状癌、包裹性乳头状癌及浸润性乳头状癌等[9]。此类肿瘤在常规诊断时需要借助免疫组化进一步明确，所以在术中冰冻时单纯依靠镜下表现，诊断难度较大[10]。对于导管内乳头状癌，肿瘤细胞存在一定的异型性，在肿瘤内部，免疫组化指标CK5/6、p63上皮细胞丢失，CK5/6、p63可见导管肌上皮阳性，如果为浸润性的乳头状癌，在浸润性癌的周边，基底细胞表达丢失。导管内乳头状瘤，形态不一，增生紊乱，免疫组化CK5/6、p63均示导管周肌上皮阳性、肿瘤细胞阳性。苏州大学附属第四医院一例乳腺肿瘤的术中冰冻，可见肿瘤细胞均匀一致，部分区域可见乳头状结构，部分细胞一致，部分细胞增生紊乱，呈筛孔状，经术中快速免疫组化CK5/6、p63验证，导管周均阳性表达，肿瘤细胞阴性，可诊断为导管原位癌，对于乳头状的区域，存在更为复杂的情况，需后续工作进一步明确。快速冰冻中，如果没有术中免疫的支持，对于肿瘤主体及乳头状结构区域的诊断，会存在一定的局限性及误诊率。

综上所述，术中快速免疫组化在肺肿瘤、乳腺肿瘤及淋巴结、可疑转移病灶活检术的冰冻快速诊断中发挥着比较重要的作用，但由于目前术中快速免疫组化抗体使用情况及范围较为局限，且一抗、二抗需低温冷藏，低温会导致一定程度的假阴性与假阳性的情况发生，所以病理技师需熟练掌握整个制片流程，在操作前将一抗、二抗从常温冰箱中取出，提前复温，达到室温水平，且在加入少量温水的湿盒中操作、染色，以保证其敏感性与特异性。

基金资助:苏州市重点扶持学科(病理学)(SZFCXK202141);苏州市科技计划项目:多组学在肿瘤药物转化医学以及临床治疗中的应用(SZM2022014);放射医学与辐射防护国家重点实验室开放研究项目(GZK12023034);

文章来源:俞士杰,熊丹婷,赵静,等.CK-pan､CK5/6､p63在术中快速诊断中的应用及意义[J].诊断病理学杂志,2024,31(06):486-489.