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罗沙司他对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞纤维化的影响

2024-10-10 117 上传者：管理员

摘要：目的观察高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13)低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达及转化生长因子-β(TGF-β)/Smads信号通路变化，探讨罗沙司他对高糖诱导的SV40 MES13细胞增殖和纤维化的影响及可能机制。方法对数生长期SV40 MES13细胞饥饿化处理24 h后采用含30 mmol/L葡萄糖的高糖完全培养基及0、1、2、3、4、5μmol/L罗沙司他溶液培养24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率，筛选最佳罗沙司他浓度进行后续实验。对数生长期SV40 MES13细胞分为对照组(采用含5.5 mmol/L葡萄糖的低糖完全培养基培养)、高糖组(采用含30 mmol/L葡萄糖的高糖完全培养基培养)、罗沙司他组(采用含30 mmol/L葡萄糖的高糖完全培养基培养+罗沙司他1μmol/L处理),培养24 h,采用ELISA法检测细胞上清液Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)水平，采用Western blot法检测细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量，采用实时荧光定量PCR法检测细胞HIF-1α mRNA相对表达量。结果 0、1、2、3、4μmol/L罗沙司他处理24 h时细胞存活率[(107.93±3.24)%、(92.44±1.20)%、(75.55±5.98)%、(40.96±3.32)%、(17.32±1.95)%]依次降低(P<0.05);5μmol/L罗沙司他处理时细胞存活率[(21.39±2.70)%]与4μmol/L处理时比较差异无统计学意义(P>0.05);1μmol/L罗沙司他处理时细胞存活率>90%,采用该浓度进行后续实验。3组细胞上清液ColⅣ、FN水平比较差异均有统计学意义(F=6.061,P=0.036;F=4.918,P=0.044);高糖组细胞上清液ColⅣ、FN水平[(2.72±1.08)、(7.58±1.03)μg/L]均高于罗沙司他组[(0.91±0.17)、(5.79±0.99)μg/L]、对照组[(1.37±0.35)、(6.39±0.82)μg/L](P<0.05),罗沙司他组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白及HIF-1α mRNA相对表达量比较差异均有统计学意义(F=5.934、6.883、5.722、4.709、79.110,P均<0.05);高糖组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3蛋白相对表达量(1.34±0.31、0.98±0.16、0.93±0.14)均高于罗沙司他组(0.57±0.35、0.60±0.07、0.44±0.25)、对照组(0.76±0.16、0.70±0.15、0.54±0.15)(P<0.05),罗沙司他组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);高糖组细胞Smad7蛋白相对表达量与罗沙司他组、对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),罗沙司他组高于对照组(P<0.05);高糖组细胞HIF-1α mRNA相对表达量(0.86±0.03)低于罗沙司他组(1.77±0.47)、对照组(1.00±0.00)(P<0.05),罗沙司他组高于对照组(P<0.05)。结论罗沙司他可抑制高糖诱导的SV40 MES13细胞过度增殖及纤维化，其机制可能与上调HIF-1α表达及抑制TGF-β/Smads信号通路有关。

关键词：
TGF-β/Smads信号通路
低氧诱导因子-1α
小鼠肾小球系膜细胞
罗沙司他
肾纤维化
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糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见微血管并发症，以多种病理改变为特征，其中肾纤维化是DN进展的关键环节[1-3]。转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路参与肾纤维化进展，其经典信号转导的下游分子Smad2、Smad3和Smad4形成复合体，转位至细胞核调控下游蛋白，促进细胞外基质蛋白表达，促进肾纤维化[4-5]。罗沙司他是一种脯氨酰羟化酶抑制剂，可诱导低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)稳定并促进内源性促红细胞生成素产生[6]。Li等[7]在叶酸诱导的肾损伤小鼠模型中发现，罗沙司他预处理可降低注射第7天后HIF-1α蛋白表达，减轻铁死亡、炎症和肾间质纤维化。罗沙司他在体外可抑制细胞增殖，通过下调TGF-β1/Smads信号通路延缓肺纤维化[8]。但目前关于罗沙司他在DN中是否有抗纤维化作用及其机制尚不清楚。本研究观察高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13)HIF-1α表达及TGF-β/Smads信号通路变化，探讨罗沙司他对高糖诱导的SV40 MES13细胞增殖和纤维化的影响及可能机制，报道如下。

1、材料与方法

1.1 一般材料

小鼠肾小球系膜细胞SV40 MES13购自武汉普诺赛生命科技有限公司，接种于含体积分数5%胎牛血清的DMEM/F12培养基(即完全培养基),于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养至对数生长期进行后续实验。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器

罗沙司他(S1007)(美国Selleck公司),DMEM培养基、Ham's F-12营养培养基、胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司),TGF-β、Smad3、p-Smad3抗体(美国CST公司),Smad7抗体(英国Abcam公司),GAPDH抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),CCK-8试剂盒、HRP标记鼠抗兔IgG二抗(武汉亚科因生物技术有限公司),Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ, ColⅣ)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)ELISA试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司),Trizol试剂(博越生物科技有限公司),反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(苏州近岸蛋白质科技股份有限公司),实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2.2 细胞活力检测及最佳药物干预浓度筛选

采用CCK-8法。细胞悬液以2×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h弃原培养液，每孔加入100 μL含体积分数0.5%胎牛血清的完全培养基饥饿化处理24 h, 弃原培养液，加入含30 mmol/L葡萄糖的高糖完全培养基及不同浓度罗沙司他溶液(0、1、2、3、4、5 μmol/L),每孔100 μL,于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱同步培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，避光培养0.5 h后，应用酶标仪检测450 nm波长处吸光度(optical density, OD)值，计算细胞存活率=(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)。实验重复3次，取平均值，以筛选最佳药物干预浓度。

1.2.3 细胞分组处理

取对数生长期SV40细胞，采用含体积分数0.5%胎牛血清的完全培养基饥饿化处理24 h后分为对照组、高糖组、罗沙司他组，对照组采用含5.5 mmol/L葡萄糖的低糖完全培养基培养24 h, 高糖组采用含30 mmol/L葡萄糖的高糖完全培养基培养24 h[9],罗沙司他组采用含30 mmol/L葡萄糖的高糖完全培养基加入1 μmol/L罗沙司他培养24 h。

1.2.4 细胞上清液ColⅣ、FN水平检测

采用ELISA法。取各组细胞上清液，4 ℃、2 000×g离心15 min, 按试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪检测450 nm波长处OD值，应用Curve Expert软件根据OD值绘制标准曲线，计算细胞上清液ColⅣ、FN水平。实验重复3次，取平均值。

1.2.5 细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量检测

采用Western blot法。取各组细胞，PBS漂洗3遍，加入100 μL裂解液，冰上裂解30 min, 离心半径8.5 cm, 12 000 r/min离心20 min, 取上清，应用BCA试剂盒进行蛋白定量。取30 μg蛋白样品行SDS-PAGE电泳，并转膜至PVDF膜。加入脱脂牛奶，室温摇床封闭0.5 h; 加入TGF-β(1：1 000)、Smad3(1：1 000)、p-Smad3(1：1 000)、Smad7(1：1 000)、GAPDH(1：50 000)抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；加入HRP标记鼠抗兔IgG二抗(1：10 000),室温摇床孵育0.5 h。滴加ECL发光液曝光、显影，应用Image J图像分析软件分析灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.2.6 细胞HIF-1αmRNA相对表达量检测

采用实时荧光定量PCR法。取各组细胞，采用Trizol试剂提取细胞总RNA,应用紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度，应用反转录试剂盒反转录为cDNA,应用荧光定量PCR试剂盒检测HIF-1α mRNA相对表达量，引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。PCR反应体系：2×NovoStartt®SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 1.6 μL,ROX 0.4 μL,RNase-Free ddH2O 6 μL,共20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 20 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算HIF-1α mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

表1引物序列表

1.3 统计学处理

应用SPSS 26.0软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差

表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 不同浓度罗沙司他处理的细胞存活率比较

0、1、2、3、4、5 μmol/L罗沙司他处理24 h时细胞存活率分别为(107.93±3.24)%、(92.44±1.20)%、(75.55±5.98)%、(40.96±3.32)%、(17.32±1.95)%、(21.39±2.70)%。0、1、2、3、4 μmol/L罗沙司他处理24 h时细胞存活率依次降低(P<0.05);5 μmol/L罗沙司他处理时细胞存活率低于0、1、2、3 μmol/L(P<0.05),与4 μmol/L处理时比较差异无统计学意义(P>0.05)。1 μmol/L罗沙司他处理时细胞存活率>90%,采用该浓度进行后续实验。

2.2 3组细胞上清液ColⅣ、FN水平比较

3组细胞上清液ColⅣ、FN水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。高糖组细胞上清液ColⅣ、FN水平均高于罗沙司他组、对照组(P<0.05),罗沙司他组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表23组细胞上清液ColⅣ、FN水平比较

2.3 3组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量比较

3组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量比较差异均有统计学意义(P<0.05)。高糖组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3蛋白相对表达量均高于罗沙司他组、对照组(P<0.05),罗沙司他组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);高糖组细胞Smad7蛋白相对表达量与罗沙司他组、对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),罗沙司他组高于对照组(P<0.05)。见表3、图1。

表33组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量比较

图1 3组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白表达Westernblot图

2.4 3组细胞HIF-1αmRNA相对表达量比较

罗沙司他组、高糖组、对照组HIF-1α mRNA相对表达量(1.77±0.47、0.86±0.03、1.00±0.00)比较差异有统计学意义(F=79.110,P<0.001)。高糖组细胞HIF-1α mRNA相对表达量低于罗沙司他组、对照组(P<0.05),罗沙司他组高于对照组(P<0.05)。

3、讨论

DN是糖尿病的严重并发症之一，也是导致终末期肾病的主要病因。肾纤维化是DN进展至终末期肾病的关键过程[10]。TGF-β被认为是肾纤维化的重要介质，而HIF与TGF-β/Smads信号通路在肾纤维化中存在联系。罗沙司他是HIF脯氨酰羟化酶抑制剂，临床广泛用于肾性贫血的治疗。罗沙司他预处理可通过促进HIF-1α表达减轻肾纤维化[11-13]。本研究分析罗沙司他在DN中抗纤维化作用及可能机制，可为DN的治疗提供新思路。

ColⅣ、FN是细胞外基质的主要组成成分。DN肾脏中系膜细胞分泌的ColⅣ、FN和层粘连蛋白增多，可加重肾纤维化[14-15]。本研究结果显示，高糖组细胞上清液ColⅣ、FN水平均高于罗沙司他组、对照组，表明高糖可诱导肾小球系膜细胞分泌ColⅣ、FN增多，引起肾纤维化[16],而罗沙司他可减轻肾纤维化程度，延缓DN进展。TGF-β是驱动肾纤维化和DN发展的主要因子，阻断TGF-β/Smads信号通路是治疗DN的有效方法[17-18]。TGF-β激活后与其受体结合导致Smad2和Smad3磷酸化，Smad2和Smad3是2个关键的下游介质，受Smad7负调控。p-Smad2、p-Smad3结合形成复合物并移位到细胞核中调节靶基因转录，参与调控细胞外基质生成等生物学活动[19]。本研究结果显示，高糖组细胞TGF-β、Smad3、p-Smad3蛋白相对表达量均高于罗沙司他组、对照组，表明高糖促进肾纤维化的发生可能与TGF-β、Smad3、p-Smad3表达上调有关[18],而罗沙司他可通过调控TGF-β/Smads信号通路抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞的纤维化进程。

HIF-1α是通过与特定DNA序列结合来响应氧水平变化的转录因子，参与调节糖酵解、血管生成、炎性反应、铁代谢、氧化应激和纤维化等基因转录。HIF-1α与TGF-β/Smads信号通路在肾纤维化中存在联系。HIF-1α可与TGF-β/Smads信号通路的Smad3结合，上调纤维化相关蛋白表达，进而促进纤维化过程[19-20]。本研究结果显示，高糖组细胞HIF-1α mRNA相对表达量低于罗沙司他组、对照组，表明高糖可能通过下调HIF-1α表达，激活TGF-β/Smads信号通路，从而加重肾纤维化[21],而罗沙司他可能通过HIF-1α和TGF-β/Smads信号通路调节DN导致的肾纤维化。

本研究结果提示，罗沙司他可抑制高糖诱导的SV40 MES13细胞过度增殖及纤维化，其机制可能与上调HIF-1α表达及抑制TGF-β/Smads信号通路有关。但本研究为细胞实验，尚需进行阻断肾小球纤维化方面的动物模型及临床研究进一步验证。

参考文献:

[1]焦晓静,阎磊,曹慧霞,等.糖尿病肾病患者肾组织Nsun2表达及意义[J].中华实用诊断与治疗杂志,2023,37(12):1211-1215.

[16]马玉,杨雯雯,范哲,等.褪黑素对高糖刺激系膜细胞NF-κB与TGF-β/Smad3通路的影响[J].安徽医科大学学报,2019,54(6):840-845.

基金资助:河南省医学科技攻关计划联合共建项目(LHGJ20200494,LHGJ20230517); 河南省科技攻关计划项目(212102310779);

文章来源:闫桐,马东红,师晶晶,等.罗沙司他对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞纤维化的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(10):992-996.