近年来，急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的发病率和病死率居高不下，且呈逐年上升趋势[1]。引起AKI的常见原因有肾缺血/再灌注损伤、肾毒性药物、脓毒血症等，主要临床表现为短时间内(数小时至数天)肾功能突然或持续下降，导致有害、有毒代谢物在体内积聚，重症患者还可进展为肾衰竭甚至死亡[2]。目前，除透析外，尚无确切的干预手段可以限制肾损伤的进展、提高AKI患者的存活率及促进损伤肾组织的恢复[3]。因此，研究AKI发生发展的机制，以制定相应的治疗方法和途径，将有助于降低AKI的发病率和病死率。

炎症反应在各种AKI 的发病机制中起着重要作用[4,5,6]。其中，巨噬细胞在免疫介导AKI的发生发展中起重要作用[7]。它既是效应细胞，也是抗原提呈细胞，可以连接先天免疫系统和适应性免疫系统，巨噬细胞的缺失可以保护肾脏免受急性损伤[8,9,10,11]。

巨噬细胞具有高度异质性，取决于微环境和疾病的性质或阶段，可分化为形态和功能上截然不同的两种表型：M1型(促炎型)和M2型(抑炎型)[12]。AKI 发生后，M1型巨噬细胞被招募到肾脏，起放大炎症反应并促进实质损伤的作用，而M2型巨噬细胞则表现出抗炎作用，促进肾脏修复[13]。

纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein2,Fgl2)是纤维蛋白原相关蛋白家族成员，具有免疫凝血和免疫调节的作用，主要由活化的巨噬细胞、T细胞、内皮细胞和肿瘤细胞产生[14]。本课题组前期的研究表明，Fgl2 通过影响巨噬细胞极化介导肾纤维化的发生发展[15],但对Fgl2在炎症密切相关的AKI中巨噬细胞极化的作用尚不清楚。本研究拟通过建立顺铂诱导的急性肾损伤(cisplatin-induced acute kidney injury, Cis-AKI)模型，利用Fgl2 基因敲除小鼠，观察Fgl2对小鼠Cis-AKI中巨噬细胞极化的作用，旨在为Fgl2的应用提供新的免疫学视角，为临床靶向治疗AKI提供新的理论依据。

1、材料与方法

1.1 实验动物

选取24只8 ～10周龄，体质量20～25 g的雄性C57BL/6J Fgl2+/+小鼠(购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司)和Fgl2-/-小鼠(由美国纽约Trudeau研究所Stephen Smiley教授馈赠)各12只。饲养于陆军军医大学免疫学研究所SPF级层流动物房，环境温度和湿度为中央空调统一控制[室温(22±2)℃,湿度60%～70%,12 h昼夜交替照明],Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠各2笼，每笼6只，自由摄食饮水。本研究经陆军军医大学实验动物福利伦理审理委员会审核(AMUWEC20232763),符合动物伦理和动物福利要求。

1.2 主要试剂与仪器

顺铂(cisplatin, Cis)购自美国 Selleck 公司；RT-qPCR 采用 SYBR Green 染料法，PCR 试剂盒购自武汉Abclonal 公司，引物由上海生工生物合成；本研究采用的抗体有：Fgl2(中国Novus 公司),F4/80(美国CST 公司),CD86、CD206(英国Abcam 公司),Percp-antimouse CD45、PE/Cy7-antimouse CD11b、PE-antimouse F4/80、Brilliant violet-antimouse MHC Ⅱ、APC-antimouse CD206(美国Biolegend公司)。Western blot 仪器购自美国Bio-Rad 公司；电泳凝胶试剂盒、电泳液、转膜液均购自武汉塞维尔公司；化学发光成像仪购自美国 LI-COR 公司；PCR 仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪(FACS Canto Ⅱ)购自美国 BD 公司。

1.3 小鼠实验模型构建与分组

通过单次腹腔注射20 mg/kg Cis 处理 72 h构建Cis-AKI小鼠模型，生理盐水(Saline)组则在同等条件下注射等体积无菌生理盐水，按随机数字表法将小鼠分成4组(n=6)。Cis-AKI模型组：Fgl2+/+ Cis 组、Fgl2-/- Cis 组，对照组：Fgl2+/+ Saline 组、Fgl2-/- Saline组。Cis溶液现配现用，将Cis粉末溶于无菌生理盐水中涡旋混匀，45 ℃水浴锅中加热20 min, 使其充分溶解成浓度为1 mg/mL的淡黄色澄清工作液。

1.4 动物标本采集及处理

给药3 d后取小鼠眼球血，室温下放置1 h后 4 ℃冰箱过夜，室温下1 000×g 离心 10 min, 取上清，用于后续肾功能检测。所有小鼠取血后，经麻醉，立即颈椎脱臼处死，摘取双侧肾脏去除包膜，一部分组织固定于 4%多聚甲醛中用于组织学检测，另一部分迅速放入液氮速冻后冻存于 -80 ℃冰箱中。

1.5 肾功能检测

小鼠血清送至陆军军医大学第一附属医院中心试验室检测血肌酐(serum creatinine, Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平，由生化自动分析器(奥林巴斯 AU5400)完成。

1.6 实验方法

1.6.1 HE染色

肾脏组织常规固定、脱水，包埋制成石蜡标本，将包埋好的组织切成4 μm薄片，脱蜡至水，苏木精染色30 s, 自来水冲洗10 min, 1%盐酸-乙醇分化 3 s, 自来水冲洗反蓝 10 min, 伊红染色25 s。切片染色完成后，经透明处理，中性树脂封片，光镜下拍照并评分。由2位经验较丰富的肾内科医生在显微镜下观察病理损伤，采用双盲法分析肾小管上皮细胞损伤，包括以下参数：小管刷状缘脱落、小管扩张、管型形成、上皮细胞坏死和炎性细胞浸润。每个标本采用双盲随机选取 5 个视野(400×)对肾小管上皮细胞损伤百分率进行量化并评分(0分：正常；1分：>0%～10%;2分：>10%～25%;3分：>25%～45%;4分：>45%～75%;5分：>75%～100%)。

1.6.2 免疫组化染色与免疫荧光染色

将石蜡切片脱蜡后浸于柠檬酸盐(pH值为6)或EDTA抗原修复液(pH值为9)中，大火煮沸3 min, 转至中低火15 min 进行抗原修复，3%过氧化氢阻断10 min、5%牛血清白蛋白室温封闭1 h, 一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗片4次，每次5 min, 二抗孵育1 h, 光镜下DAB 显色，苏木精染色30 s, 二甲苯透明后中性树脂封片。免疫荧光步骤基本同上，注意避光孵育荧光二抗，Hoechst染色10 min后，抗荧光淬灭封片剂封片。

1.6.3 肾脏浸润炎症细胞分离与流式细胞术

将肾组织浸于DMEM培养基中，剪至约1 mm3 的碎块，加入Ⅳ型胶原酶37 ℃消化30 min, 70 μm 细胞筛网去除筋膜等杂质，加红细胞裂解液冰上裂解红细胞5 min, 用Percoll进行梯度离心，上层为40% Percoll溶液，下层为80% Percoll 溶液，4 ℃、800×g离心30 min, 缓升缓降，溶液分层后，位于中间白膜层的细胞即为肾脏中的炎症细胞。用1 mL胎牛血清与99 mL PBS溶液混合成流式染色缓冲液，洗涤离心后的白膜层细胞沉淀用残液重悬，每个流式管加入1 μL anti-mouse CD16/32封闭液，冰上封闭15 min 后，不洗涤直接加入一定量抗小鼠抗体混悬液(Percp-CD45、PE/Cy7-CD11b、PE-F4/80、Brilliant violet-MHCⅡ、APC-CD206),冰上避光孵育30 min后洗涤离心，400 μL流式染色缓冲液重悬后立即上机进行检测。

1.6.4 肾脏mRNA提取与RT-qPCR检测

使用RNA 提取液(武汉塞维尔公司)从肾脏组织中提取总mRNA,并使用分光光度计测定mRNA浓度，采用cDNA反转录试剂盒(武汉Abclonal公司)反转录合成cDNA,RT-qPCR反应体系：引物1 μL,cDNA 1 μL,无RNA酶水 3 μL,SYBR 5 μL,总体积10 μL。反应条件：预变性95 ℃,3 min, 共 40 个循环：95 ℃ 5 s, 58 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s。得到各组样品扩增反应的Ct值，采用 2-ΔΔCt 计算相对表达量。引物序列见表 1。

1.6.5 Western blot检测

取约30 mg肾组织于研磨管中，加入蛋白裂解液，将样品放入研磨仪(Servicebio, KZ-Ⅲ-F)中，以60 Hz的频率研磨30 s, 循环2次后转移研磨管中的组织匀浆至1.5 mL标记好的离心管中，冰上裂解30 min, 15 000×g、4 ℃离心15 min, 取上清用分光光度计检测蛋白浓度，按照4∶1的比例加入loading buffer, 100 ℃变性10 min。取40 μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，150 mA 1 h 电转至 PVDF膜，封闭30 min, 一抗4 ℃孵育过夜；0.1% TBST漂洗后加入HRP标记二抗(山羊抗兔抗体 1∶3 000,山羊抗小鼠抗体1∶3 000),室温孵育1 h; 0.1% TBST 漂洗后ECL化学发光剂显色，LI-COR曝光仪显影照相。

表1 引物序列

1.7 统计学分析

Image J软件分析 Western blot、免疫组化染色及荧光染色结果，Flow Jo 10.8.1软件分析流式细胞术结果。实验数据采用 GraphPad Prism 9.5.1 软件进行分析和绘图，计量资料以x¯

表示，两两比较采用非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P值已经LSD事后检验法进行校正，P<0.05 为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Fgl2 在 Cis-AKI 小鼠肾脏中的表达上调

为研究Fgl2在AKI中的作用，通过单次腹腔注射Cis构建Cis-AKI小鼠模型。结果显示：与Fgl2+/+ Saline组比较，Fgl2+/+ Cis组小鼠肾组织中Fgl2的蛋白和mRNA水平均显著升高(P<0.05,P<0.001,图1A、B);免疫组化染色结果显示，Fgl2在肾组织中的表达明显增加，且主要表达于皮质中的肾小管上皮细胞，肾间质中也有少量表达(P<0.001,图1C)。提示Fgl2可能参与Cis-AKI的发生发展。

图1 Fgl2在Cis-AKI小鼠肾脏中的表达  

2.2 Fgl2的缺失加重小鼠Cis-AKI

进一步研究发现，与Fgl2+/+ Cis组比较，Fgl2-/- Cis组小鼠血清中Scr、BUN水平显著升高，反映肾功显著下降(P<0.001,图2A),肾组织中肾损伤相关分子：肾损伤分子 1(kidney injury molecule 1,Kim-1)蛋白及mRNA水平均显著上升，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)mRNA 水平显著上升(P<0.001,P<0.05,图2B、C)。HE染色显示，与Fgl2+/+ Saline组比较，Fgl2+/+ Cis组小鼠肾小管上皮细胞明显肿胀、刷状缘消失、细胞从基底膜上坏死脱落、管型形成、管腔扩张，肾小管损伤病理评分明显升高；与Fgl2+/+ Cis组比较，Fgl2-/- Cis组小鼠肾脏上述病理改变更为显著(P<0.05,图 2D)。以上结果表明，Fgl2基因敲除对Cis-AKI 的发展起促进作用。

2.3 Fgl2 敲除促进 Cis-AKI 小鼠肾脏巨噬细胞浸润

为探究Fgl2敲除促进Cis-AKI的作用机制，检测各组小鼠肾脏巨噬细胞的浸润情况。免疫组化与免疫荧光染色结果发现，与Fgl2+/+ Cis组比较，Fgl2-/- Cis组小鼠肾脏浸润的巨噬细胞(F4/80+)数量显著增多(P<0.001,图3A、C)。流式细胞术结果示，与Fgl2+/+ Cis组比较，Fgl2-/- Cis组小鼠肾脏免疫细胞中F4/80+ 细胞百分比明显升高(P<0.05,图3B)。以上结果表明Fgl2敲除促进Cis-AKI 小鼠肾脏中巨噬细胞的浸润。

图2 Fgl2基因敲除对Cis-AKI的影响

图3 Fgl2敲除对Cis-AKI小鼠肾巨噬细胞浸润的影响  

2.4 Fgl2敲除促进Cis-AKI小鼠肾脏巨噬细胞向M1型极化

为进一步探讨Fgl2对AKI中肾脏巨噬细胞极化的影响，检测各组小鼠肾组织中巨噬细胞极化情况。RT-qPCR 结果发现：与Fgl2+/+ Cis组比较，Fgl2-/- Cis组小鼠肾脏M1型巨噬细胞相关炎症因子IL-1β、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、TNF-α的表达水平均显著升高(P<0.05,图4A),IL-12P40表达差异无统计学意义。流式结果显示，与Fgl2+/+ Cis组鼠比较，Fgl2-/- Cis组小鼠肾脏总巨噬细胞中，M1型巨噬细胞(F4/80+MHCⅡ+)百分比明显升高，而 M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)百分比无明显变化，且M1型巨噬细胞百分比明显高于M2型(P<0.001,图4B)。双色免疫荧光结果显示：与Fgl2+/+ Cis组比较，Fgl2-/- Cis组小鼠肾脏M1型巨噬细胞(F4/80+CD86+)浸润显著增多，与流式细胞术结果一致(P<0.01,图5)。

图4 Fgl2敲除对Cis-AKI小鼠肾巨噬细胞极化及M1型相关炎症因子表达的影响

1:Fgl2+/+Cis组;2:Fgl2-/-Cis组;a:P<0.05,b:P<0.01,c:P<0.001，与Fgl2+/+Cis组比较;d:P<0.05，与Fgl2+/+Cis组中M1型巨噬细胞占比比较;e:P<0.001，与Fgl2-/-Cis组中M2型巨噬细胞占比比较A:RT-qPCR检测小鼠肾肾脏M1型巨噬细胞相关炎症因子(i NOS、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-12p40)的mRNA水平;B:流式细胞术检测肾组织中M1型巨噬细胞(F4/80+MHCⅡ+)或M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)占比及统计结果

图5 Fgl2敲除对Cis-AKI小鼠肾M1型巨噬细胞极化的影响

3、讨论

AKI是一组以肾功能快速下降为主要特征的临床综合征，有着较高的发病率和死亡率，每年约有170万人因此死亡；其病因复杂，常由肾缺血/再灌注损伤、肾毒性药物、脓毒血症等引起[2,16]。Cis临床应用复杂，以肾毒性为主的副作用阻碍了其在化疗中的应用，高达25%的AKI病例由临床药物如Cis的使用引起[17]。本研究构建了Cis-AKI动物模型，模拟临床上Cis所致的肾毒性作用，通过研究其作用机制，为临床预防或治疗Cis的肾毒性作用提供新的理论依据。

强烈的炎症反应是AKI的重要特征，也是加剧肾损伤的重要因素，本课题组前期研究表明，Fgl2基因敲除对横纹肌溶解诱导急性肾损伤(rhabdomyolysis induced acute kidney injury, RM-AKI)的保护作用可能与炎症反应减轻有关[18]。巨噬细胞是肾脏炎症的主要效应细胞，可产生一系列具有细胞毒性、促炎和抗炎等特性的介质，影响损伤的发生发展[19,20]。Fgl2具有免疫调节活性，可通过与巨噬细胞相互作用参与多种炎症相关疾病的进展[14],如XIAO等[21]发现Fgl2基因的缺失通过影响巨噬细胞活性抑制病毒诱导的暴发性肝炎的进展。HU 等[22]发现Fgl2通过与TLR4相互作用加重非酒精性脂肪性肝炎，引起巨噬细胞炎症并诱导肝脂代谢紊乱。HU等[23]的研究证实了Fgl2可通过调控巨噬细胞糖酵解重编程，加重酒精性肝损伤。现有的与Fgl2和巨噬细胞相互作用有关的文献中，Fgl2主要通过参与巨噬细胞极化这一机制对炎症相关疾病的发生发展产生影响。因此推测，Fgl2或许可通过调节AKI中巨噬细胞极化影响疾病的进程。有研究表明，Fgl2可通过影响巨噬细胞极化介导肾纤维化的发生发展[15],但Fgl2对AKI中炎症反应、巨噬细胞的作用尚不清楚。本研究通过建立小鼠Cis-AKI模型，发现与Fgl2+/+小鼠比较，Fgl2-/-小鼠肾功能下降，肾组织病理损伤明显加重，早期肾损伤相关分子表达显著升高，肾组织中浸润的巨噬细胞明显增多，这些结果表明Fgl2基因缺失通过增加巨噬细胞浸润，促进炎症反应加重Cis-AKI。

巨噬细胞被认为在免疫介导的肾损伤中具有重要功能，连接先天性免疫系统和适应性免疫系统[5]。巨噬细胞具有高度异质性，可根据其微环境、疾病类型和阶段表现出不同的表型和功能特征[12],通常可极化为促炎(M1 型)巨噬细胞和抗炎(M2型)巨噬细胞，这两种亚型之间的平衡在组织炎症、损伤和修复过程的调节中起着关键作用[24]。在AKI的发生发展过程中，M1型巨噬细胞的作用至关重要，可产生促炎细胞因子(TNF-α、IL-12和IL-6)和一氧化氮(nitric oxide, NO)。NO与ROS相互作用产生ONOO-引起脂质过氧化；TNF-α 则通过促进肾损伤后肾小管凋亡导致进一步肾小管损伤[25];M1型巨噬细胞还可以与受损小管上皮细胞产生的富含miR-23a的外泌体或损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)相互作用募集更多的M1型巨噬细胞，促进肾间质炎症[26];有研究表明，在AKI发生前使M1型巨噬细胞耗竭可缓解AKI的进展[25],说明抑制M1型巨噬细胞极化可作为治疗AKI的重要方法。本研究发现在Cis-AKI模型中，与Fgl2+/+小鼠比较，Fgl2-/-小鼠肾组织中巨噬细胞的数量明显增加，且M1型巨噬细胞的极化明显增强，表明Fgl2基因敲除显著增强了AKI肾组织中M1型巨噬细胞的极化。

本研究仍存在以下不足：在进行Fgl2基因敲除时，模型选用的是Fgl2基因全敲小鼠，而并未探讨在条件性敲除小鼠巨噬细胞中Fgl2基因的情况下，对Cis-AKI病理过程的影响。既往研究表明，可通过将原代肝细胞与Fgl2+/+ 或 Fgl2-/- 骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)共培养，在体外模拟条件性敲除巨噬细胞中Fgl2基因的情况下，对疾病可能产生的影响，探索Fgl2在非酒精性脂肪性肝炎中的作用机制[22]。因此，在后续研究中，将以此为参考，将原代肾小管细胞与Fgl2+/+或Fgl2-/- BMDMs 共培养，讨论在特异性敲除巨噬细胞中Fgl2基因的情况下，Cis-AKI将如何发生发展。

综上所述，本研究通过建立Cis-AKI小鼠模型，发现Fgl2基因敲除可通过促进肾脏中炎症因子水平、巨噬细胞浸润与活化以及M1型巨噬细胞极化，参与AKI的病理过程。该发现为Fgl2的应用提供了新的免疫学视角，为临床靶向治疗AKI提供了新的理论依据。

参考文献:

[18]邓秋苗,潘鑫,许桂莲,等.Fgl2在小鼠横纹肌溶解诱导急性肾损伤中的作用及其机制[J].陆军军医大学学报,2023,45(12):1272-1280.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(8187032042);重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2023NSCQ-MSX0570)~~;

文章来源:朱琳,许桂莲,谢攀,等.Fgl2对小鼠急性肾损伤中巨噬细胞极化的作用[J].陆军军医大学学报,2024,46(13):1467-1476.