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关于矩阵式PCR扩增仪的研究

2020-06-15 235 上传者：管理员

摘要：针对PCR扩增仪的使用需求，设计了矩阵式PCR扩增仪。该扩增仪采用四个独立的孔反应槽，使用半导体制热制冷片对其升温和降温，每个反应槽均可单独设定工作温度。采用ARM微处理器作为系统的主控制器；围绕DS18B20数字温度传感器设计反应槽温度采集电路；以PID控制理论为基础，结合温度控制电路，对温度进行控制。反应槽温度控制范围0～100℃，精度为±0.5℃，升温速率最大可达5℃/s，每个反应槽均可单独设定12个温度点。经测试，该扩增仪达到了设计指标要求，可同时完成四批不同温度设定的基因扩增。

关键词：
PCR
扩增仪
温度
生物化学
矩阵
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聚合酶链式反应又称为基因扩增技术，是由美国生物学家KaryMullis于20世纪80年代初发明[1,2]。采用PCR技术，能够简便、特异、敏感、快速地完成特定基因片段的扩增，极大地提高检测灵敏度。因此，PCR技术迅速成为生物学和临床基因诊断的基本手段，广泛应用于生命科学、生物医学、临床诊断和法医鉴定等众多领域[3]。

随着PCR技术的发展，PCR扩增仪应运而生。第一台PCR扩增仪由美国PE公司在20世纪80年代末开发，随后PCR扩增仪得到了广泛的应用和发展，各个国家，包括我国在内，均有各种不同类型的设备开发[4,5,6,7,8]。

PCR扩增仪本质上是通过控制反应温度来实现基因扩增目的，一次扩增要经过高温变性、低温退火和中温延伸等3个步骤。一般情况下，进行一次扩增要将这3个步骤循环20～30次[9]。通过不断地发展，PCR扩增仪已日趋完善，但普遍在扩增过程中使用的温度设定是不能改变的。这种情况对实验研究，特别是探索不同退火温度对扩增的影响时，需进行多次扩增，耗费大量的时间，效率很低。

本文设计了一种矩阵式PCR扩增仪，该扩增仪采用4个独立的反应槽，使用半导体制热/制冷片分别对其升温和降温，每个反应槽均可单独设定高温变性、低温退火和中温延伸等3个工作温度，可同时完成四批不同温度设定的基因扩增。

1、扩增仪系统框图

1.1系统框图

本系统主要由ARM控制器及人机接口电路、温度传感器测量电路、功率驱动电路、半导体制热/制冷片和反应槽等部分组成，系统框图如图1所示。

图1PCR扩增仪系统框图

1.2工作原理

ARM控制器通过人机接口电路输入各反应槽需要设定的温度值以及其他需要设定的参数，通过液晶屏显示温度、时间等数据；温度测量电路采用数字温度传感器DS18B20测量反应槽实际温度，并将测量值传送给ARM控制器；ARM控制器以PID控制理论为基础，采用PWM方式控制功率驱动电路为半导体制热/制冷片供电，从而实现反应槽的温度控制。

2、反应槽结构

该扩增仪设计有4个独立的反应槽，构成2×2矩阵形式，各反应槽的结构均相同，其顶视示意图和后视示意图分别如图2和图3所示。

图2反应槽顶视示意图

图3反应槽后视示意图

每个反应槽均有16个反应腔，最大可同时进行16份样品的扩增，因此，整个扩增仪最大可同时进行64份样品的扩增。

在每个反应槽的背面均安装有4片制热/制冷片，通过功率驱动电路分别控制其对反应槽升温或降温，这种安装方式可有效保障反应槽温度控制的一致性；在制热/制冷片周围安装有4个数字温度传感器DS18B20，负责测量反应槽各部分的温度。温度控制系统根据温度设定值与测量值的差值，分别控制各制热/制冷片加热或制冷。此种设计可有效提高对反应槽温度测量的准确性，保障对反应槽扩增温度的准确控制。

3、系统硬件设计

3.1温度测量电路

温度测量电路中采用DALLAS公司生产的数字化温度传感器DS18B20来测量反应槽温度，该传感器可将反应槽的温度直接转换为数字值，极大地简化温度测量电路设计以及与ARM控制器的连接。

DS18B20的温度测量范围为-55～+125℃，可通过编程实现9～12位的测量精度，分别对应0.5℃、0.25℃、0.125℃和0.0625℃的精度[10]。

该传感器支持一线总线接口，且每个DS18B20在出厂时都已具有唯一的64位序列号，因此在一线总线上可以同时挂接多个DS18B20，轻松构建传感器网络。

PCR温度测量电路如图4所示。

图4温度测量电路

电路由16个DS18B20传感器构建成温度传感器网络，每4个DS18B20传感器作为一组，分别测量4个反应槽的温度。

DS18B20由外部+5V电源供电；其数据线DQ连接在一起构成一线总线，接入ARM微处理器通用I/O口PE端口的nGPE＿DSDQ；为保证DS18B20在温度转换或写入数据时1mA的电流供应，在数据线上接一上拉电阻，即图4中的电阻R101，其阻值可选4.7kΩ。

3.2功率驱动电路

功率驱动电路负责为半导体制热/制冷片供电，控制其制热或制冷，从而实现反应槽的温度控制。

要控制半导体制热/制冷片的制热或制冷，需要为其提供正向或反向电流。因此，功率驱动电路采用了典型的H桥形式驱动电路[11,12]，选用4只NMOS管IRFP3205组成H桥，其具有导通电阻RDS小，数据手册标称值仅为8.0mΩ，电流ID可以达到110A等优点。

H桥功率驱动电路为两侧对称电路，单侧电路如图5所示，另一侧电路与之完全相同。

图5H桥单侧功率驱动电路

在该电路中，采用IR2110作为大功率管IRFP3205的驱动和控制器。IR2110是大功率MOSFET和IGBT的专用驱动集成电路[13,14]，其承受高压的高边外围电路采用自举方式，减少电源路数，并设有外部保护封锁端口，使电路得到有效精简。

图中，C204为自举电容，D201为自举二极管，共同构成自举电路。自举元件参数可利用参考文献[13]计算。

单侧IR2110的控制信号输入端HIN、LIN和SD分别接入ARM通用I/O口PE端口的nGPE＿HIN1、nGPE＿LIN1和nGPE＿SD；另一侧IR2110的输入信号同理接入。

ARM控制器产生两路PWM信号，通过nGPE＿HIN1和nGPE＿LIN1输出，分别传送给IR2110的HIN和LIN，两路信号互补。通过调整该信号的占空比，可控制制热或制冷速度的快慢。

3.3ARM控制器和人机接口

ARM控制器采用三星公司的S3C2410芯片作为主控制器；人机接口电路由液晶显示、键盘输入和声响提示等电路组成。这些电路均为常规电路，已有许多资料详细介绍[15,16,17]，不再赘述。

4、系统软件设计

PCR扩增仪系统软件采用C语言编制，考虑到软件的编写、调试和管理，采用模块化结构[18]。系统软件主要包括主程序模块、温度设定模块、温度采集模块和温度控制模块等。

4.1主程序模块

主程序模块为系统主程序，通过调用温度设定模块、温度采集模块和温度控制等模块实现系统功能。其流程图如图6所示。

图6主程序流程图

在系统初始化模块中，主要设置系统工作需要的一些初始参数，以及对系统进行自检。

温度设定模块通过人机接口电路输入各反应槽需要设定的高温变性、低温退火和中温延伸等3个工作温度，以及其他需要设定的参数。

4.2温度采集模块

温度采集模块负责完成对温度传感器DS18B20测量的反应槽温度数据的读取。其流程图如图7所示。

图7温度采集流程图

由于温度测量电路是由16个DS18B20温度传感器所构建成的温度测量网络，因此，在读取温度传感器DS18B20的温度数据时，必须区分其所处位置，以便精确测量各点的温度。由于每个DS18B20在出厂时都已具有唯一的64位序列号，且在安装时已记录下对应的位置，所以，通过读取其序列号即可读取指定位置的温度数据。

4.3温度控制模块

温度控制模块根据实际温度与设定温度值的比较，控制制热或制冷。采用PID算法控制PWM波形的占空比，实现半导体制热/制冷的控制。

PID算法如式（1）所示。

温度控制流程图如图8所示。

图8温度控制流程图

5、结论

针对基因扩增研究工作的需要，本文设计了矩阵式PCR扩增仪。经实际测试，该扩增仪的温度控制范围为0～100℃，精度为±0.5℃，升温速率最大可达5℃/S；该扩增仪每个反应槽均可单独设定12个温度点，并可同时完成四批不同温度设定的基因扩增，达到了设计要求。经实验室实际使用，能有效提高实验工作效率，满足研究工作的需要。

参考文献：

[1]罗曼.浅谈基因扩增仪检测技术[J].计量与测试技术,2015,42(3):67-68.

[2]俞璐云.PCR技术应用举例及发展前景[J].农村经济与科技,2018,29(14):280-281.

[3]马立人,蒋中华.生物芯片[M].北京:化学工业出版社,2001.

[6]张晶,金毅,周文刚,等.一种PCR热循环仪[S].北京:中国知识产权出版社,ZL93216290.8,1994.4.20.

[7]连一霏,于海娇,徐明鑫,等.新型基因扩增仪的调试方法[J].广东微量元素科学,2015,22(3):52-54.

[8]朱磊,魏银文,高贯虹,等.核酸扩增仪中温度的控制研究[J].测控技术,2014,33(4):86-93.

[9]廖红华.芯片级PCR仪温度模糊PID控制器设计与仿真[J].仪表技术与传感器,2012(5):85-88.

[10]周秀明,曹隽,张春龙.基于DS18B20的单片机温度检测与调节系统设计[J].实验室科学,2011,14(1):79-81.

[11]宋玉宏,周定艺,詹金远,等.基于STM32单片机的电机驱动设计[J].顺德职业技术学院学报,2018,16(2):6-9.

[12]陈新兵,张方樱,龙晓莉.基于Proteus的高性能电机驱动设计[J].电子设计工程,2017,25(17):73-87.

[13]唐宁.功率驱动器IR2110自举电路分析及应用[J].微处理机,2018(4):25-28.