多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是石油的主要组分之一，具有致癌、致畸、致突变等毒性特征[1],油田石油开采、运输以及各类石油化工生产过程导致油田土壤中的PAHs污染富集，威胁生态环境安全和居民身体健康。然而，我国陆上石油开采区大多处于盐碱土壤环境，加上高盐钻井废液泄漏和海水倒灌等因素，造成油田区和盐渍化土壤区高度重叠[2,3]。

微生物降解作为PAHs在自然界消散和转换的主要方式之一，受到了国内外学者的高度重视[4]。大量研究表明，细菌是降解PAHs最高效、最具潜力的生物修复手段，而针对不同环境筛选分离PAHs高效降解菌是该项技术的关键环节[5]。盐度作为细菌生长和代谢过程中的重要因素之一，过高的盐度胁迫会导致耐受性较差的微生物细胞脱水或裂解，进而影响污染物的修复效果[6,7]。已有报道开展了耐盐或嗜盐PAHs降解菌的筛选工作，如王慧等[8]从长期受石油污染的土壤中分离出一株能降解菲、荧蒽、芘、苯并蒽的嗜盐菌，经鉴定为海旋菌；Wang等[9]在3%盐度条件下的活性污泥中分离出增强菲降解的菌株Martelella sp.AD-3;甄静等[10]从石油污染土壤中分离筛选一株耐受不良环境的菲芘降解菌F3-1。然而，目前能够在盐胁迫环境中高效降解PAHs的微生物资源仍然不足，且对耐盐和嗜盐降解菌在应对盐胁迫时的响应方式和耐盐机理尚不明确。

本文以胜利油田含油污泥为对象，通过高通量筛选系统分离出1株能够高效降解菲的耐盐菌株，对该菌在不同程度盐胁迫下的生长规律、细胞膜组成和相容性溶质含量进行分析，探讨了该菌株对盐胁迫的响应方式，为油田土壤PAHs生物修复提供了宝贵的微生物资源，为理解耐盐微生物对盐胁迫的响应机理提供了可行的研究思路。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1污泥来源

胜利油田含油污泥。来源于胜利油田某含油污泥堆场，主要来自采油厂联合站的储油罐以及少量回收的落地油污染土壤，样品为不含游离水的固体块状污泥，含油率平均为(2.05±0.28) g/kg。

1.1.2试剂和培养基

PBS缓冲液：28.39 g Na2HPO4,24.0 g NaH2PO4,4.385 g NaCl, NaOH溶液调节pH=7.2,蒸馏水定容至500 mL,121℃高压灭菌15 min,备用。

TTC显色剂：称取2 g 2,3,5氯化三苯基四氮唑溶解于蒸馏水，定容至100 mL,121℃高压灭菌15 min,备用。

LB液体培养基：25.0 g LB肉汤溶解于1 000 mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15 min,备用。

LB琼脂培养基：40.0 g LB营养琼脂溶解于1 000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min后分装至一次性无菌细胞培养皿，备用。

无机盐培养基(ISM):4.62 g无机盐培养基，2.0 g铵盐，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15 min,备用。

含菲的无机盐培养基(ISM-PHE):在已灭菌的无机盐培养基中加入一定量的菲丙酮溶液(过0.22μm无菌滤膜),使培养基中菲质量浓度达到25μg/mL,待丙酮挥发完全后备用。

1.2方法

1.2.1 PAHs降解菌的分离鉴定

(1)降解菌株的驯化分离。

称取1.00 g含油污泥加入到50 mL的ISM-PHE培养基中，放入恒温振荡仪，30℃、150 r/min的条件下培养5 d;对培养完成的培养液进行稀释，将稀释液分别涂布在LB琼脂培养基上，涂布完成放入生化培养箱30℃培养48 h。

利用QPix420高通量筛选仪器，从LB琼脂培养基上选取生长状态良好的单菌落挑至含有菲的96孔板内培养3 d,添加TTC显色剂后孔板内菌液呈明显红色，表明菌液内含有能够以菲为底物进行生长代谢的菌株[无色的水溶性TTC在活细胞线粒体酶的作用下可被还原为红色的水不溶性产物甲腊(formazan)[11,12]]。选取上述菌液进行富集培养，最后通过3次平板划线进一步纯化获得单菌株。

(2)菲降解率的测定。

将筛选分离获得的菌种接入LB培养基进行富集培养，培养24 h后用PBS缓冲液洗去培养基，然后用PBS缓冲液与菌体混合，通过分光光度计标定样品600 nm波长处吸光值(OD600)为1.0的菌悬液。

取1 mL菌悬液接至50 mL ISM-PHE培养基中，放入恒温振荡仪30℃、150 r/min培养7 d,以不接菌处理作为对照组(CK),各处理均做3组平行；培养完成后用二氯甲烷萃取培养基中残留的菲，利用旋转蒸发法去除二氯甲烷，最后加入5 mL乙腈溶解菲后过膜(0.45μm有机滤膜)并存放于液相色谱进样瓶，通过高效液相色谱仪(HPLC)测定菲的浓度，HPLC条件参考《水质 多环芳烃的测定 液液萃取和固相萃取高效液相色谱法》(HJ 478—2009)[13],该方法加标回收率为82.8%～94.2%,平均回收率为81%,相对标准偏差(RSD)<8.86%。

(3)PAHs降解菌的鉴定。

将筛选得到的单一降解菌株，采用细菌通用上下游引物27F和1492R扩增降解菌的16S rDNA基因[14],由青岛擎科生物科技有限公司完成测序工作后，通过NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S rDNA数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种和序列信息，使用MEGA-7软件利用N-J法构建了系统发育树，对菌种进行鉴定[15]。

1.2.2不同盐度下PAHs降解菌降解能力测定

移液枪移取1 mL PBS菌悬液(OD600=1.0)接至50 mL不同盐度的ISM-PHE培养基中，通过分别添加0、1%、3%、5%和7%的氯化钠将培养基设置为5个盐度梯度，放入恒温振荡仪30℃、150 r/min培养7 d,以不接菌处理作为对照组(CK),各处理均做3组平行，结果取平均值。为比较所分离菌株的降解能力，选取已知的两株菲降解菌作为对照，分别为多食鞘氨醇杆菌L-11(Sphingobacterium multivorum,保藏号CGMCC No.1951)和红平红球菌L-12(Rhodococcus erythropolis,保藏号CGMCC No.3095)。

1.2.3不同盐度下PAHs降解菌生长曲线测定

LB培养基生长曲线测定：取所筛选菌株的菌液各200μL接至50 mL的LB培养基进行富集培养，移液枪移取1 mL PBS菌悬液(OD600=1.0)接入100 mL 0、1%、3%、5%、7% NaCl的LB,分别以LS、S1、S3、S5、S7为标签，放入恒温振荡仪30℃、150 r/min培养。在时间点0、12、24、48、60、84、96、120和168 h分别取样检测OD600值[16,17]。ISM培养基生长曲线测定：菌液来源与LB培养基测定来源相同取1 mL PBS菌悬液(OD600=1.0)接入100 mL 0、1%、3%、5%、7% NaCl的ISM培养基同样分别以LS、S1、S3、S5、S7为标签，样品在时间点12、24、48、72、96、120和168 h分别取样检测OD600值。各盐度处理均做3组平行，结果取平均值。

1.2.4不同盐度下PAHs降解菌细胞膜脂肪酸组分测定

取所筛菌株200μL接至50 mL LB培养基，放入恒温振荡仪30℃、150 r/min富集培养48 h;取1 mL培养完成的菌液接入不同盐度(0、1%、3%、5%、7% NaCl)的LB培养基，根据盐度不同继续在恒温振荡仪进行富集培养48～96 h;培养完成后将LB培养基成分离心去除，获得的菌体沉淀在冰箱-20℃过夜后进行冷冻干燥；称取干燥样品100 mg,加入4 mL氯仿，3 500 r/min室温离心15 min;取下层液体加入2 mL二氯甲烷，离心15 min,弃上清液；两次萃取后合并下层液体，氮气吹干；后加入2 mL甲基化试剂涡旋30 s, 80℃水浴2 h;水浴后待冷却，加入正己烷2 mL、水1 mL,涡旋30 s, 2 000 r/min离心5 min;取上清液加水1 mL,涡旋30 s, 2 000 r/min离心5 min,取上清液氮气吹干；根据样品浓度加入适当体积的异辛烷，涡旋30 s,静置5 min,将溶液转移至进样瓶，通过气相色谱仪(GC)测定脂肪酸含量；采用CP-Sil 88(100 m×0.25 mm×0.25μm)气相色谱柱，初始柱温100℃,终止柱温240℃,流速1.0 mL/min,进样量1μL[18,19]。

1.2.5不同盐度下PAHs降解菌胞内四氢嘧啶测定

以改良80%乙醇抽提法[24]提取胞内四氢嘧啶(Ectoine)。将降解菌株接至含0、1%、3%、5%、7% NaCl的50 mL LB培养基中进行培养。培养完成后，将培养液于4℃、8 000 r/min离心5 min,收集菌体；用10 mL PBS缓冲液洗涤菌体2次，8 000 r/min离心5 min,弃上清液；冻干菌体，称干重；加入2 mL 80%乙醇溶液，漩涡振荡器振荡30 min, 8 000 r/min离心15 min,保留上清液，其沉淀重复抽提1次，合并两次抽提的上清液；电热鼓风干燥箱60℃干燥至结晶，用纯水溶解结晶后过0.22μm有机滤膜，存放于液相色谱进样瓶，最后利用HPLC测定四氢嘧啶含量。Ectoine检测波长是204 nm,流动相采用乙腈/水(体积比7∶3),EclipseXDB-C18柱，4.6 mm×150 mm,柱温20℃,压强400 bar,进样量10μL,流速1.0 mL/min,运行时间5 min[20,21]。

1.3数据统计分析

使用Microsoft Excel 2010软件对原始数据进行整理。利用IBM SPSS 27.0软件，采用单因素方差分析法(ANOVA)比较不同盐度处理组的数据之间的差异性(显著性水平设定为P<0.05),事先进行方差齐性检验，方差相等时采用最小显著差异(LSD)法，方差不相等时采用塔姆黑尼(Tamhanes’T2)法。

2、结果与分析

2.1降解菌株的分离鉴定

以菲为唯一碳源，利用含油污泥作为菌源富集和筛选PAHs降解微生物。经多次富集培养、平板初筛和高通量筛选，最终获得1株降解能力较高的菌株，将其命名为A-5。对菌株A-5进行16 S rDNA测序，将得到的序列与GenBank中已知序列进行比对[15]。菌株A-5序列上传到GenBank获得序列号OP493115,将该序列与NCBI上已报道的16S rDNA序列进行Blast分析，与A-5序列相似性最高的为Pseudarthrobacter属菌株，选取相关菌株的16S rDNA序列用Neighbour-joining方法构建系统发育树如图1所示，结果表明，菌株A-5与P. phenanthrenivorans (菲假节杆菌)亲缘关系最近，序列相似性值为99.9%,因此将A-5菌株鉴定命名为P. phenanthrenivorans A-5。

2.2不同盐度下A-5的生长曲线

盐度是影响微生物生长的环境因素之一，在一定盐度范围内微生物通过调节自身新陈代谢以适应盐度的变化[22]。菌株A-5在LB培养基中的生长情况如图2所示。结果表明，菌株A-5在不同盐度环境下的生长曲线存在一定差异。LS与S1组在12 h内迅速进入对数生长期；S3组在12～24 h迅速生长进入对数生长期；而S5、S7组迟滞期较长，两组分别在48 h、96 h后迅速进入对数生长期，快速生长；LS组与S1组在120 h后生长速度放缓甚至数量开始减少。不同盐度下，菌株在较高盐度下生长有所延迟但依旧生长到较高生物量，说明菌株A-5能耐受7%以下的盐度环境，这与其他报道中耐盐降解菌的耐受范围相似[23,24,25]。

图1菌株A-5基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树  下

图2不同盐度的LB培养基中菌株A-5的生长曲线 

LS为不添加NaCl的处理；S1为添加1% NaCl的处理；S3为添加3% NaCl的处理；S5为添加5% NaCl的处理；S7为添加7% NaCl的处理。

2.3不同盐度下A-5对PAHs的降解能力

图3为菌株A-5在不同盐度环境下对菲的周降解率。结果表明，A-5在不添加NaCl的LS组对菲的周降解率为95.45%±1.17%,在添加1%NaCl的S1组降解率为91.20%±4.86%,S3组中的降解率为79.54%±1.66%,而在S5组、S7组的相对高盐条件下，A-5对菲的周降解率仅为2.98%±0.30%、1.56%±0.55%,该菌株在0～3%盐度下对菲表现出较好的降解能力。通过方差分析表明，S1与LS组降解率对比无显著性差异(P>0.05),而S3组的降解率显著低于S1和LS组，S5和S7组与LS组对比均呈显著性差异(P<0.05)。说明0～1%的盐度范围适宜菌株A-5发挥降解作用；在3%的盐度下该菌株的代谢效率受到一定抑制，菌株对菲的降解率有所降低但降解效率仍保持80%左右；而在5%～7%的盐度下该菌株的代谢效率受到强烈抑制，使其对菲的降解率趋近于0。将菌株A-5与对照菌L-11和L-12以及其他报道中筛选分离获得的耐盐PAHs降解菌株相比较[26,27],表明菌株A-5不仅具有较高的菲降解能力，还能够耐受3% NaCl的盐环境并发挥降解效能。

图3不同盐度的菌株对菲的降解率 

LS为不添加NaCl的处理；S1为添加1% NaCl的处理；S3为添加3% NaCl的处理；S5为添加5% NaCl的处理；S7为添加7% NaCl的处理。柱形图上方不同字母代表菌株在不同盐度下降解率的显著性差异(P<0.05)。

不同盐度下A-5在降解体系中的生长情况(图4)表明，LS和S1组中菌株的生长趋势相近，A-5能够迅速进入对数生长期并开始发挥底物代谢功能；而S3处理组中细菌的生长则相比其他两组较为缓慢，而S5和S7处理组中细菌几乎无生长。该结果说明低于1%的盐度为降解菌A-5的适宜环境，超过该范围将导致该菌生长繁殖受到影响，进而抑制其降解能力。其他研究也报道了相似的结论：随着环境盐度的升高，菌株细胞内外渗透压增大，抑制细胞对胞外养分的摄取及其他生理功能，进而影响菌株的生长繁殖速率[28,29,30]。

2.4不同盐度下A-5细胞膜脂肪酸组成

测定菌株A-5在不同盐度下的膜脂肪酸的各成分含量，以探究菌株细胞膜对盐胁迫的响应(图5和图6)。通过分析各处理组中A-5细胞膜的脂肪酸组成成分，共检测出34种中长链脂肪酸成分，其中，以棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、肉豆蔻烯酸(C14:1)、棕榈油酸(C16:1)为主要成分。比较不同盐度处理组中脂肪酸组成，结果表明，以C16:0与C18:0为主的饱和脂肪酸整体随着盐度的增加含量逐渐下降，而以C14:1和C16:1为主的不饱和脂肪酸含量整体则是随盐度增加而逐渐增加。细胞膜不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值(不饱和度，UFA/SFA)则随盐度的增加而增大。通过方差分析表明，S1、S3处理组对比LS组的不饱和度无显著性差异(P>0.05),S5和S7处理组的不饱和度对比LS组均具有显著性差异(P<0.05)。研究表明，微生物细胞膜脂肪酸组分的改变是其应对环境高盐胁迫的主要方式之一[31,32,33]。

图4不同盐度的ISM-PHE培养基中菌株A-5的生长情况  

LS为不添加NaCl的处理；S1为添加1% NaCl的处理；S3为添加3% NaCl的处理；S5为添加5% NaCl的处理；S7为添加7% NaCl的处理。

图5不同盐度的LB培养基中菌株A-5脂肪酸含量 

LS为不添加NaCl的处理；S1为添加1% NaCl的处理；S3为添加3% NaCl的处理；S5为添加5% NaCl的处理；S7为添加7% NaCl的处理。柱形图上方不同字母代表在不同盐度下各脂肪酸含量的显著性差异(P<0.05)。

2.5不同盐度下A-5胞内四氢嘧啶含量

如图7所示，菌株A-5的四氢嘧啶含量在不同处理组间存在显著性差异，其浓度从整体上随着环境盐度的增大而升高，其中，最低值出现在S3组，四氢嘧啶浓度为(207.19±4.84)μg/mL,而最高值出现在盐度最高的S7组，达到(732.12±16.67)μg/mL。菌株A-5体内四氢嘧啶的浓度与盐度呈一定的正相关关系，证实了该菌具有产生四氢嘧啶来应对盐胁迫的机制，即通过在胞内积累四氢嘧啶来抵消细胞内外渗透压差，进而维持菌株的正常生理功能[34,35,36]。

图6不同盐度的LB培养基中菌株A-5脂肪酸不饱和度变化  

LS为不添加NaCl的处理；S1为添加1% NaCl的处理；S3为添加3% NaCl的处理；S5为添加5% NaCl的处理；S7为添加7% NaCl的处理。柱形图上方不同字母代表在不同盐度下脂肪酸不饱和度的显著性差异(P<0.05)。

图7不同盐度的LB培养基中菌株A-5胞内四氢嘧啶含量变化

LS为不添加NaCl的处理；S1为添加1% NaCl的处理；S3为添加3% NaCl的处理；S5为添加5% NaCl的处理；S7为添加7% NaCl的处理。柱形图上方不同字母代表在不同盐度下四氢嘧啶含量的显著性差异(P<0.05)。

3、结论

本文采用高通量筛选技术，从胜利油田含油污泥中筛选分离获得了1株耐盐高效菲降解菌，并探究了该菌株对盐胁迫的响应机制，主要结论如下：

(1)将筛选出的降解菌株A-5进行16S rDNA序列比对分析，鉴定其为Pseudarthrobacter phenanthrenivorans,该菌在7%以下盐度的LB培养基内均能较好生长；

(2)菌株A-5在3%以下的盐度范围内对菲有较好的降解效果(周降解率不低于79.54%),当盐度超过5%时生长速率减缓、菲降解能力显著降低；

(3)随环境盐度增大，菌株A-5细胞膜不饱和脂肪酸含量增加，饱和脂肪酸含量减少，不饱和度显著升高；

(4)菌株A-5胞内四氢嘧啶含量随环境盐度增大而显著升高，推测该菌具有通过积累四氢嘧啶来平衡细胞内外渗透压的响应机制。

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基金资助:国家重点研发计划项目(No.2019YFC1804103);山东省自然科学基金项目(No.ZR2021QD115);山东省重大创新工程项目(No.2021CXGC011201);

文章来源:李文静,季蕾,李天元,等.一株耐盐菲降解菌的筛选及其对盐胁迫的生理响应[J].生物学杂志,2024,41(03):103-108.