1、引言

泛素是由76个氨基酸组成的小分子蛋白质,其主要功能是标记需要被分解的蛋白质,然后被26s蛋白酶体所降解。每一个泛素分子中有7个赖氨酸位点(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63),除了N末端的甲硫氨酸(Met)通过肽键与另一个泛素的C端形成的线性泛素链以外,其他7个位点的赖氨酸残基之间也可以通过异肽键形成泛素链,因此泛素链的类型可以是多种多样的,即泛素链的长短,连接类型,以及泛素类似物的参与都会导致泛素化修饰的多样性,即所谓的泛素密码[1,2,3,4,5]。不同的泛素化修饰参与到不同的生物进程之中,底物的单泛素修饰广泛存在且在细胞中扮演重要的角色,具有多个Lys残基的底物蛋白可以同时被多个单泛素修饰,例如抑癌基因P53[1];不同链接类型的泛素修饰也参与不同的生命活动,研究表明:K6链接类型的泛素链主要参与线粒体自噬;K11类型的泛素链主要参与细胞周期的调控;K27类型的泛素链主要参与DNA损伤修复;K29主要参与蛋白酶体应激;K33链接类型的泛素链主要参与细胞运输;K48和K63类型的泛素链分别参与到蛋白降解和炎症免疫信号的传导生物过程中[6,7];混合类型泛素链可以参与NF-κB信号通路以及蛋白的运输过程,例如K11和K63混合泛素链所介导的MHCI受体分子的泛素化过程;分支类型的泛素链由于泛素分子的不同修饰会存在不同的功能[1,8]。因此,泛素密码的存在保证了生命活动的正常运行,为生命活动提供了支撑。

泛素化和去泛素化(图1)作为翻译后修饰的过程,参与众多生命活动。泛素化过程是指泛素分子在E1(泛素激活酶),E2(泛素结合酶),E3(泛素连接酶)三种酶的共同参与下,将泛素链连接到底物蛋白上,从而将底物蛋白进行修饰[9,10]。作为蛋白翻译后修饰的过程,泛素化过程参与到蛋白降解,信号转导,细胞自噬和DNA损伤修复等过程中,并且它也参与了细胞周期,细胞增殖,基因表达,转录,炎症和肿瘤等生命活动和疾病的调控[11,12]。经典的泛素化修饰往往被认为蛋白会通过泛素-蛋白酶体(UPS)途径降解[1]。UPS是真核细胞中错误折叠、不成熟以及损伤蛋白质降解的主要途径,有大约80%的蛋白通过此途径被降解,所以其对维持细胞蛋白质稳态起到至关重要的作用[13,14]。去泛素化是泛素化过程的逆过程,参与到不同疾病的发生发展中。去泛素化过程需要去泛素化酶(DUB)的参与,去泛素化酶可以以不同的速率水解泛素羧基末端的酯键,肽键以及异肽键,从而将泛素分子从泛素化的底物蛋白以及蛋白前体上水解下来,反向调节泛素化过程,维持蛋白质和泛素的稳态[15]。目前已知人类基因组编码的去泛素化酶有100多种,包括两大类,半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶,具体又分为六大家族:USP家族(泛素特异性蛋白酶);UCH家族(泛素羧基末端水解酶);MJD家族(含有Machado-Josephin结构域的蛋白酶);OTU家族(卵巢肿瘤蛋白酶),MINDY家族(与含有泛素的新型DUB家族相互作用的基序)以及JAMM家族(JAB1,MPN,MOV34家族)[16]。UCHL3属于UCH家族中的重要成员之一,参与到众多生命活动之中,例如癌症,神经退行性疾病以及胚胎发育的发生发展。

蛋白的修饰多种多样,包括甲基化、去甲基化、乙酰化、去乙酰化,磷酸化和去磷酸化等修饰过程。蛋白的修饰调控参与诸多生命活动,包括细胞的生长与分化等。磷酸化作为其中重要的修饰调控方式,参与众多肿瘤癌症的发生发展,例如某些激酶的磷酸化调控所导致下游特定基因的变化而诱发疾病的发生。蛋白被磷酸化之后,其功能上会表现为活性被激活或抑制,或者活性上调或下降[17,18]。近年来。关于去泛素化酶的磷酸化调控越来越多,UCHL3作为去泛素化酶UCH家族中的重要成员之一,已有文献报道通过其激酶的磷酸化可以增强其去泛素化酶活性[19]。并且有报道称许多其他去泛素化酶也会受到磷酸化调控的影响从而参与信号传导等更多生命活动的调控[20,21]。对去泛素化酶磷酸化调控的研究目前仅仅局限于其功能活性所导致的效应和结果,而对于其导致功能变化的结构基础了解还很少。所以了解磷酸化的结构基础为我们进一步了解蛋白质,并且对于一些靶向药物的设计也会提供一定的思路。本文综述了近年来UCHL3的结构、功能、以及磷酸化调控机制等方面的研究进展。

图1:泛素化和去泛素化

2、UCHL3的结构与功能研究

2.1结构研究:

UCH家族中共有四个成员,其中UCHL1和UCHL3结构比较简单,只含有一个UCHdomain;UCH37和BAP1除了UCHdomain之外,还含有其他复杂结构域(图2)。目前已有对UCHL1,UCHL3和UCH37的结构性研究;BAP1结构域复杂,目前没有对其结构的相关的报道[22]。UCHL3蛋白全长共有230个氨基酸,其结构简单,只含有一个UCHdomain。根据之前的研究报道,UCHL3具有底物选择性,它只能够切割泛素连着的小的缀合物以及泛素和蛋白之间的肽键和异肽键,然而不能将泛素链切割成单个泛素(图3)[23]。已有结构解析UCHL3与泛素乙烯基甲酯(UbVME)的复合物晶体结构。该小分子与UCHL3活性中心的半胱氨酸形成共价复合物,结构阐明UCHL3结构中的crossoverloop具有底物过滤的效果,限制泛素C末端水解下的片段大小[24]。生化实验研究也表明,增加crossoverloop长度可以使UCHL3对泛素链具有切割能力[25,26]。近来,已有研究利用晶体学的方法解析了UCHL3与K27diUb链接类型泛素链的结构,这也是第一次针对UCH家族的去泛素化酶与泛素链的晶体结构。通过分析其内在相互作用位点,揭示了UCHL3对K27链接类型泛素链的识别机制:游离的K27diUb呈致密构象,但与UCHL3结合后,其构象被重塑为开放式结构。结构研究表明UCHL3可以作为K27链接类型泛素链的特异性识别蛋白发挥作用,但仍然对其没有切割活性[27]。UCHL3与许多疾病的联系暗示其重要作用,但是其细胞底物以及泛素链底物仍有许多未被鉴定,通过这些结构的解析,我们可以分析其允许底物的大小,并且可以推测UCHL3发挥其去泛素化酶活性,很可能是以二泛素为识别基础,对三泛素或者更长的泛素链进行切割。这些为寻找UCHL3的底物以及拓宽其底物范围奠定了一定的结构基础。

图2:UCH家族成员结构域信息

图3:去泛素化酶UCHL3的切割活性

2.2功能研究:

UCH家族作为DUB家族中的重要成员之一,由于其参与众多的生命活动,近年来,越来越多的研究开始关注UCH家族成员和恶性肿瘤之间的联系,它们在不同的肿瘤之中扮演着不同的角色。UCHL1作为肿瘤的启动子和抑制子目前还是有争议的;UCHL3和UCH37被认为是肿瘤的启动子;而BAP1被认为是肿瘤的抑制子。研究表明,UCH家族的成员在肿瘤的发生,侵袭和迁移中发挥着重要作用。UCHL3作为该家族中的主要成员之一,已经有研究表明UCHL3与多种疾病相关,并且也参与到多种生命活动之中[22]。

2.2.1UCHL3与肿瘤癌症的关系

肿瘤癌症严重威胁着人类的生命安全,已经有越来越多的报道证明UCHL3与众多肿瘤癌症的发生发展和侵袭存在关系。例如:上皮-间质转化(EMT)作为肿瘤发生发展进程及侵袭转移中的重要过程,其表达上调可以减少上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,破坏细胞间的连接,使上皮细胞极性丧失,增加肿瘤细胞的侵袭和转移[28]。在前列腺癌症,敲除正常前列腺癌细胞中的UCHL3会诱导EMT发生,导致癌症的迁移和侵袭;而增加高度转移性前列腺癌UCHL3的表达,可以逆转EMT现象的发生,并且减少癌细胞的转移和侵袭[29]。因此,UCHL3可以在前列腺癌中作为一个EMT的调节因子,为前列腺癌的治疗提供一些新的思路;乳腺癌作为世界上的高发疾病之一,严重危害着人类的生命安全。之前的研究表明:与正常组织中UCHL3的mRNA水平相比,乳腺癌组织中的mRNA水平明显上调;mRNA水平高的的乳腺癌患者相对于mRNA水平低的患者来说其预后水平会比较差[30]。这些数据为分析UCHL3与乳腺癌之间的关系提供一定的理论支持,并为治疗乳腺癌提供一些思路。三阴性乳腺癌是一种侵袭性的癌症,约占所有癌症的15%[31,32]。由于它缺乏受体,无法使用激素进行治疗。因此,三阴性乳腺癌的治疗在临床依然是一个挑战[33]。UCHL3作为一种去泛素化酶,在三阴性乳腺癌中高度表达,且与病人的预后有着密切关系。近期研究表明,UCHL3能够去泛素化RAD51,从而促进RAD51参与到DNA损伤修复过程中,因此UCHL3的过表达使癌细胞对DNA损伤产生抵抗能力。以UCHL3为靶标发现其上游AKT激酶抑制剂perifosine,联合PARP抑制剂共同使用,可以明显减少癌细胞的数量。这一发现为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的治疗思路[34]。卵巢癌是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因,只有15%的卵巢癌能够在早期或局限性阶段被诊断出来,大多数卵巢癌通过手术和细胞减少的方式进行治疗,其5年生存率约为47%[35,36,37]。炎症已被证明在卵巢癌细胞生长中起作用,研究表明去泛素化酶UCHL3在卵巢癌患者体内高度表达,且患者的预后效果差。NF-κB通路能够参与到机体的炎症反应之中,TRAF2是NF-κB相关炎症通路中一个重要的受体蛋白。UCHL3能够通过其去泛素化能力稳定TRAF2蛋白,从而激活NF-κB通路,从而促进卵巢癌的发展[38]。这一发现也为卵巢癌的治疗提供一些思路。

2.2.2UCHL3与神经性疾病和学习记忆的关系

许多神经退行性疾病,如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(Huntington)和肌萎缩性侧索硬化(ALS),其病人中枢神经系统的细胞内或细胞外聚集着突变或损伤的蛋白。这些蛋白的异常积累是诱发神经退行性疾病的重要标志,且影响这些蛋白聚集的的重要过程即泛素化。UCHL3会失活而损害其去泛素化活性[39]。神经退行性疾病患者大脑体内积聚一些突变的泛素分子(UBB+1),这些突变泛素分子会被UCHL3水解而变成正常泛素分子,参与到神经退行性疾病的发生发展中;且研究表明,在氧化环境条件下,UCHL3会失活而损害其水解能力[39]。因此,UCHL3可能为神经退行性疾病治疗提供一些重要线索;有研究表明,UCHL3也与学习和记忆有相关性,UCHL3在哺乳动物的学习、记忆和突触的可塑性中发挥作用,发现敲除UCHL3基因的小鼠相对于野生型小鼠来说有明显的学习缺陷,这种受损的性能是由于显著增强的工作记忆错误所导致的[40]。UCHL3对于哺乳动物的空间学习和记忆有新的作用,这些研究能够为学习和记忆功能的提高提供一些理论依据。

2.2.3UCHL3与细胞的分化、成熟、发育和凋亡的关系

成骨细胞功能的减弱会导致骨质疏松,甚至会导致全身骨障碍退行性疾病。UCHL3与成骨细胞的分化有密切关系。骨形态发生蛋白(BMP)2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一[41]。BMP2通过与Smad1相互作用并激活Smad1,诱导下游基因的表达,从而诱导成骨细胞分化[42]。研究表明,UCHL3能够与Smad1相互作用而显著的降低其多聚泛素化水平,在UCHL3高表达的细胞中,成骨细胞的分化能力增强,UCHL3通过稳定Smad1通路而影响成骨细胞的分化[43];在卵母细胞中,UCHL3主要与纺锤体的减数分裂相关,UCHL3通过影响减数分裂中纺锤体的形成而影响受精和胚胎发育过程,抑制UCHL3的表达,减数分裂过程中GV期的一部分皮质颗粒不能够迁移到皮质区域停留在细胞质中,从而影响卵母细胞分化为成熟的卵细胞[44,45];UCHL3也在细胞凋亡中发挥作用,研究表明,UCHL3缺失的小鼠显示视网膜变形,UCHL3缺失会导致线粒体氧化应激相关的感光细胞的凋亡[46];泛素化是调节众多细胞凋亡机制中重要的途径,许多凋亡相关因子例如P53、Bcl-2家族、Caspase家族蛋白酶等是通过泛素化来调节细胞的凋亡。例如敲除UCH-L3基因的小鼠患隐睾病后发现其睾丸萎缩并且能够促进凋亡基因P53、Bax、Caspase3的表达显著增加,UCHL3显著的减少生殖细胞凋亡[47]。

2.2.4UCHL3与DNA损伤修复的关系

同源重组(HR)是哺乳动物细胞DNA双链断裂(DSB)修复的主要途径之一。HR的发生会导致基因组的不稳定,从而诱导癌症的发生。HR过程是由蛋白RAD51引导的同源链交换,Rad51被BRCA2招募到DSBs中。RAD51的泛素化阻止了BRCA2-RAD51的相互作用,从而会影响DNA损伤修复。去泛素化的RAD51促进了BRCA2-RAD51结合和RAD51的招募,因此RAD51的去泛素化对HR过程至关重要。已有研究报道称UCHL3能够去泛素化RAD51而参与到DNA损伤修复过程中。去泛素酶UCHL3被ATM磷酸化,能够增强UCHL3对RAD51的去泛素化,促进RAD51与BRCA2的结合,增加其参与调控的同源重组过程[19]。

2.2.5UCHL3与恶性疟原虫以及脂肪形成之间的关系

UCHL3除了在某些重大的疾病以及各种生理调控中起着重要作用以外,UCHL3还被报道出与某些寄生虫相关,尤其是恶性疟原虫,在宿主体内维持生存的必要条件。泛素化系统,是某些寄生虫类疾病治疗的重要靶点[48]。例如,已有研究报道使用蛋白酶体抑制剂对疟疾寄生虫具有致死作用[49,50]。因此针对此系统中重要成员UCHL3的研究对治疗恶性疟原虫引发疾病具有重要意义;胰岛素是一种有效的脂肪形成激素,可以触发一系列转录因子,诱导特定蛋白的生成,这些蛋白促进前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。研究表明,UCHL3能够促进胰岛素信号和脂肪形成,在缺失UCHL3基因的细胞中,与胰岛素相关的蛋白的表达受损,从而减少脂肪的形成;并且,具有活性缺陷的UCHL3不能够促进胰岛素信号传导,并且使得胰岛素相关蛋白的表达受损[51]。

3、UCHL3调控的机制研究

UCHL3作为UCH家族中的重要成员之一,其参与到众多疾病和生命进程中,所以对UCHL3的调控也显得重要。UCHL3作为去泛素化酶家族中的一员,在之前的研究中被认为是只能切割单泛素及其缀合物,或者泛素结合酶与泛素复合物,并不能对泛素链进行切割。2016年,LuoK等报道称UCHL3是一种新型的DNA损伤修复调节因子,可以对RAD51(DNArepairproteinRAD51homolog1)进行去泛素化。通过ATM蛋白激酶对UCHL3的磷酸化调控,会大大增强其对RAD51泛素链的切割活性,并且鉴定出磷酸化位点为75位丝氨酸[19]。我们也通过体外酶活实验证明,相比于UCHL3WT蛋白,UCHL3S75E在不同酶浓度下均展现出一定的活性提高,在同等酶量以及底物(Ub-AMC)浓度条件下UCHL3S75E的切割活性约为UCHL3WT的1.9倍,证实UCHL3在磷酸化调控之后其切割活性有所提高(图4)。但这个过程中UCHL3的作用以及调控机制目前尚不清楚。之前已有研究表明,很多去泛素化酶活性的调节与磷酸化调控相关。例如:泛素-蛋白酶体系统(UPS)是维持细胞内蛋白质稳定的关键。Usp14是调节UPS的关键性去泛素化酶,它也是Akt(丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶)的底物,Akt对Usp14Ser423位点进行磷酸化,无论在体内还是体外都会激活该酶的去泛素化活性,这个位点使得Usp14的催化位点处于非活性构像之中。磷酸化调控会激活Usp14的去泛素化酶活性[52,53];锚蛋白G与神经发育障碍有关,包括智力障碍、自闭症、精神分裂症和双相情感障碍,Usp家族成员之一Usp9X是一种神经发育障碍相关的去泛素酶(DUB),研究表明,Usp9X可以与锚蛋白G相互作用,且磷酸化调控可以增强其相互作用,从而减少锚蛋白G的多聚泛素化,稳定锚蛋白G以维持树突棘的发育[54];去泛素化酶DUBA属于OTU家族中的成员之一,其在自然状态下是无活性的,对其177位的丝氨酸进行磷酸化,可以激活其活性。其晶体复合物结构也解析磷酸化调控对其活性的激活是必不可少的[55]。对这些磷酸化调控的去泛素化酶的研究对UCHL3的调控研究具有很重要的指导基础,对深入理解UCHL3的作用及调控与被调控机制,以及探索UCHL3真实底物具有重要意义。

图4:UCHL3的水解活性

4、展望

近年来,有关去泛素化酶的研究越来越多,UCH家族和肿瘤之间的关系也受到了越来越多的关注,UCHL3作为该家族中的成员之一,也受到了很大的关注,但是对其研究仍然不充分,尚有问题需要解决。例如,UCHL3与多种肿瘤有关,但其如何参与到肿瘤的发生发展中,其在肿瘤的发生发展中的确切作用仍不明确;UCHL3的准确底物是什么,这对其参与肿瘤的发生过程机制有重要作用;UCHL3参与的细胞凋亡等过程的信号转导通路与蛋白通路尚不明确;UCHL3的去泛素化活性已经明确,并且研究表明磷酸化调控可以增强其去泛素化活性,但是对于是何种泛素链底物以及是否拓宽泛素链底物类型,泛素链的切割位点,以及磷酸化影响其活性的机制仍然需要进一步研究;对上述问题的探讨可以为UCHL3参与的肿瘤的发生发展以及参与生物过程的发生提供新的认识,并且为疾病的靶向治疗提供新的理论基础

参考文献：

[18]敖世洲.蛋白质可逆磷酸化对细胞活动的调节.上海:上海科学技术出版社;1994.

[20]李林.蛋白质磷酸化作用的结构基础[J].生物化学与生物展1997,24(4):290-295.

任禹静,王丰.泛素羧基末端水解酶L3的研究进展[J].生命科学仪器,2020,18(02):14-22.

基金:国家重点研究发展计划(2016YFC0906000);国家自然科学基金项目(31140022,21736002,31770827和31961133015);北京理工大学青年学者研究基金项目.