西瓜和苹果均含有丰富的矿物质和多种维生素,且富含多种生物活性成分,如多酚、黄酮、有机酸,这些活性成分均具良好的保健功能[1,2].因体外模拟胃肠道环境消化法可以较真实地模拟食物在人体内胃肠道消化过程中的pH和酶环境,能够更真实地模拟人体内环境,比传统的体外化学方法更为科学.同时,这种方法还具有周期短、重现性好、节约资源、易于控制等特点.所以在近年来,体外模拟消化已经成为众多研究者们所亲睐的研究方法之一.无疑,对西瓜和苹果进行体外模拟抗氧化活性以及变化规律的深入研究,有利于对它们进一步的开发利用.

自由基具有强氧化性的特点,如机体中存在过量的自由基,会对机体的组织和细胞造成损害,给人体健康带来危害[3].目前最合理的解决方法是补充外源性抗氧化剂,因为在人们日常生活中食用的很多食物中都含有天然抗氧化剂,如葡萄、西瓜、苹果等水果.因此,日常食品中的抗氧化成分的探究一直是研究热点.

另外,由于消化是人体摄取营养物质的关键步骤,而消化系统有其复杂性,传统的有机溶液提取法对食物在人体的转换、降解、不完全释放等变化过程无法完全掌控[4],在反映活性物质的真实代谢以及变化规律上有一定的局限性.但众多研究表明,体外消化在模拟人体环境方面表现得更加突出,能够更加贴近实际地模拟出食物在人体内胃肠道消化过程中的pH和酶环境.除此之外,使用体外消化还可以节省大量的试验材料,能够更好地对操作过程进行控制[5],重现性好.因此,使用体外模拟消化模型来模拟人体的胃肠道消化,能够对食品的抗氧化价值做出更准确、便捷的评价.

目前,围绕西瓜苹果等果蔬的功能及活性成分开展的研究很多[6,7,8,9,10],但基于体外模拟胃肠消化评价其抗氧化活性的研究较少.因此,本研究以西瓜及苹果为试验材料,利用体外胃肠模拟消化体系,分别检测了西瓜和苹果消化前后对各类自由基清除能力的影响,同时对胃肠消化后抗氧化活性的变化规律进行了分析,为西瓜及苹果的体内代谢研究及其资源的开发利用提供依据.

1、材料与方法

1.1材料与试剂

材料:西瓜(品种:京欣);苹果(品种:富士).

试剂:DPPH(Sigma-Aldrich);胃蛋白酶(广州市左克生物科技发展有限公司);胰蛋白酶(广州市左克生物科技发展有限公司);猪胆盐(北京华迈科生物技术有限责任公司);其它试剂,如亚硝酸钠、无水乙醇、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、浓盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠等,均为分析纯.

1.2仪器与设备

水浴恒温振荡器(SHZ·82A,上海博珍仪器设备制造厂);台式冷冻离心机(GT15RT,上海浦东天本离心机械有限公司);榨汁机(MJ-BL25B2,美的);pH计(ST3100,奥豪斯仪器有限公司)、移液枪(艾本德中国有限公司);水浴锅(SHZ.82A,上海博珍仪器设备制造厂);全波长扫描式多功能酶标仪(varioskanflash,赛默飞世尔科技有限公司).

1.3试验方法

1.3.1样品制备

将苹果及西瓜切为小块后用榨汁机榨汁打碎,6000r/min,4℃,4min,取上清液50mL[8].

1.3.2人工胃液和肠液的配制

(1)人工胃液:

取稀盐酸(取盐酸234mL,加水稀释到1000mL)16.4mL,加水约800mL与胃蛋白酶10g,摇匀后,调节pH至1.3,加水稀释成1000mL,即得[11].

(2)人工肠液:

取磷酸二氢钾6.8g,加水500mL使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠,溶液调节pH值至6.8,另取胰酶10g,25g猪胆盐加水适量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000mL,即得[12].

1.3.3体外模拟胃肠消化

模拟胃液、肠液空白对照组:取果汁上清液25mL,加水1mL,而后与模拟胃消化试验组共同消化取样;取模拟胃消化1h的空白对照组,加入1.5mL水,而后继续消化取样[13].

模拟胃液消化组:取果汁上清液25mL于锥形瓶,水浴37℃后,1mol/LHCl调节pH=1.3,再加入1mL模拟胃液,用锡箔纸将锥形瓶包好避光,于37℃、转速100r/min的恒温水浴摇床消化,于消化的0.5h、1h、2h、3h、4h取样,每次取样2.5mL,并将所取样品迅速置于70℃水浴5min灭活,随后放至冰箱冷却,经10000r/min离心6min后,取上清液分别测定DPPH自由基、羟基清除能力、亚硝酸根清除能力和还原力[14].

模拟肠液消化组:基于模拟胃消化样品的分析结果,模拟胃消化1h后,作为肠消化的0h,取稀释过的苹果及西瓜上清液20g于锥形瓶,水浴37℃后,经过模拟胃消化1h后,1mol/LNaHCO3调节pH至6.8,加入1.5mL肠液.用锡箔纸将锥形瓶包好避光,继续置于37℃、转速100r/min的恒温水浴摇床中,持续消化4h,于模拟肠消化0.5h、1h、2h、3h、4h取样,每次取样2.5g,将所取样品迅速置于70℃热水浴5min,随后放至冰箱冷却,经10000r/min离心6min后,取上清液分别测定.

1.3.4抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一个稳定的自由基,其乙醇溶液呈深紫色,在可见光区波长517nm处有一强吸收.当自由基清除剂加入DPPH溶液中时,由于自由基清除剂提供1个电子使单电子配对,从而使其吸收逐渐消失,褪色程度与接受电子数呈化学计量关系.因此通过吸光度的变化来检测样品清除自由基的能力,可以评价样品的抗氧化能力.200μmol/L的DPPH乙醇溶液的配置:称取DPPH15.0mg加无水乙醇定容至200mL.

样品的测定:试验组分别往小试管中加入2mL样品梯度液,继续加入2mLDPPH乙醇溶液,充分混合,避光静置30min,在波长为517nm处测定其吸光度.空白组用水代替样品,用乙醇代替DPPH乙醇溶液作为对照组,避光静置30min,漩涡震荡,517nm测定其吸光度,各组平行测3次[15].按式(1)计算DPPH自由基清除率:

C=(1−A1−A2A0×100%)         (1)

式(1)中:C为自由基清除率,A1为试验组(加样品和试剂)吸光度值,A2为对照组(未加试剂)吸光度值,A0为空白组(未加样品)吸光度值.

(2)FRAP还原力的测定

抗氧化物质将Fe3+还原为Fe2+,Fe2+与2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)结合生成蓝色络合物,在波长593nm处有最大光吸收.吸光度越大,表明抗氧化剂的还原能力越强,因而具有越高的抗氧化活性.

FRAP试剂:将300mmol/L的醋酸缓冲液(pH=3.6),10mmol/L的TPTZ溶液,20mmol/L的FeCl3·6H2O以10∶1∶1混合(现配现用).

样品测定:分别取20μL样液于不同试管,然后各试管加1.8mLFRAP试剂,混匀,37℃水浴10min,在波长595nm处测其吸光值.

(3)NO2-清除率的测定

在25mL具塞试管中,加入一定浓度的样品溶液2mL和1mLNaNO2标准溶液(5μg/mL),并在37℃恒温水浴锅中反应30min.取出后立即向其中加入1mL0.4%的对氨基苯磺酸混匀,稳定静置5min后加入0.5mL0.2%盐酸萘乙二胺溶液,加水至10mL,摇匀后,稳定15min,以样品溶液为空白测定吸光值,波长为538nm.通过NaNO2量,标准曲线得出残留的NaNO2量,并按式(2)计算NO2-清除率:

ρ=n1−n2n1×100%         (2)

式(2)中:ρ为NO2-清除率,n1为NaNO2量,n2为残留的NaNO2量.

(4)羟自由基清除率的测定

H2O2和Fe2+混合发生Fenton反应,水杨酸可以有效捕获活性高的羟基自由基,最终生成有色物质;如果存在清除作用的物质,那么它就会与水杨酸竞争,致使有色产物的生成量减少.

依次向试管中加入待测样品2mL(空白组除外)、6mmol/LFeSO4溶液2mL(对照组除外)、2.5mmol/LH2O2溶液2mL(对照组除外),摇匀,静置10min,再加入6mmol/L水杨酸乙醇溶液(对照组除外)2mL,加水定容至10mL,摇匀,37℃水浴30min,3000r/min离心10min,取上清液测定在510nm波长下测定值,羟自由基清除率的计算方法参照DPPH自由基清除率公式(1)计算.

1.3.5数据处理方法

所有试验均重复3次,计算平均值,试验数据表示:平均值±标准差.

2、结果与讨论

2.1消化时间与DPPH自由基清除率的关系

西瓜和苹果果汁分别通过胃、肠阶段进行不同时间的消化后,DPPH自由基清除率的变化情况如图1、图2所示.

图1西瓜模拟胃肠消化产物的DPPH自由基清除率

图2苹果模拟胃肠消化产物的DPPH自由基清除率

由图可知,在经过胃、肠消化后,同等消化条件下,西瓜胃消化DPPH自由基清除率大于肠消化DPPH自由基清除率;苹果肠消化DPPH自由基清除率大于胃消化.模拟胃消化过程中,西瓜果汁中DPPH自由基清除率在消化1h内升高并达到最大值,然后略微下降并趋于稳定;苹果果汁中DPPH自由基清除率在消化1h内显著升高,随后又下降,在4h达到最大值.模拟肠消化过程中,西瓜果汁中DPPH自由基清除率在消化1h内显著升高并在消化2h时达到最大值,随后即开始下降,且在3～4h时下降幅度较大;苹果果汁中DPPH自由基清除率先降低后升高并在消化2h时达到最大值,然后下降并趋于稳定.

西瓜在经过肠消化后DPPH自由基清除率小于胃消化组,这可能是因为西瓜中含有其他抗氧化活性成分,如天然色素[2]、有机酸[16]等,由于天然色素和有机酸的抗氧化作用都十分强烈,并且这两者均只能在偏中性的肠液中保留少部分,因而对于DPPH自由基的清除能力略弱.

苹果在经过肠消化后DPPH自由基清除率大于胃消化组,这是因为苹果经肠消化后可以促进多酚释放,因此肠消化组的DPPH自由基清除率大于胃消化组.

2.2FRAP还原力的测定

西瓜和苹果果汁分别通过胃、肠阶段进行不同时间的消化后,测定了FRAP的还原力情况,如图3、图4所示.

图3西瓜模拟肠胃消化产物的FRAP浓度

图4苹果模拟肠胃消化产物的FRAP浓度

由图可知,在模拟胃消化过程中,西瓜的铁离子还原能力先降低后升高,在0.5h达到最高值159.2mmol/L,2h达到最低值;苹果的铁离子还原能力在胃消化1h达到最大值(580.7mmol/L),而后下降,3h时再次升高,随后再次下降.在模拟肠消化过程中,消化2h的样品其铁离子还原能力最高58.2mmol/L,随后趋于稳定;苹果的铁离子还原能力基本维持不变(185.1～232.9mmol/L).对比发现,西瓜及苹果模拟消化后铁离子的还原能力均为胃消化大于肠消化.

由于铁离子还原能力反映出的是样品所有的还原能力,而非仅针对于某一自由基的清除活性.因此,由于有机酸的大量存在,所以肠消化液组的铁离子还原能力小于胃消化液组[17,18].

2.3NO2-的清除

西瓜和苹果果汁分别通过胃、肠阶段进行不同时间的消化后,测定了对NO2-的清除率的变化情况,如图5、图6所示.

图5西瓜模拟肠胃消化产物的亚硝酸根清除率

图6苹果模拟肠胃消化产物的亚硝酸根清除率

由图可知,在模拟胃消化过程中,西瓜的亚硝酸根清除率在消化1h达到最高值67.9%;苹果的亚硝酸根清除率,消化3h达到最高值64.0%.模拟肠消化过程中,西瓜果汁消化4h后的亚硝酸根清除率升高至72.8%,随后趋于稳定;苹果果汁消化2h后的亚硝酸根清除率升高至85.1%,随后趋于稳定.经对比发现,西瓜及苹果在模拟消化后亚硝酸根清除率均为肠消化大于胃消化.

2.4消化时间与羟自由基清除率的关系

西瓜和苹果果汁分别通过胃、肠阶段进行不同时间的消化后,测定了对羟自由基清除率的变化情况,如图7、图8所示.

图7西瓜模拟肠胃消化产物的羟基清除率

图8苹果模拟肠胃消化产物的羟基清除率

由图可知,在模拟胃消化过程中,在0.5h时西瓜的羟自由基清除率达到最大值为84.1%,在4h时其羟自由基清除率下降到最小值;在4h时苹果消化产物的羟自由基清除率上升至最高为84.6%,在2h时苹果消化产物的羟自由基清除率为最小值.经肠消化之后,西瓜消化产物的自由基清除率基本未变,在0.5h时即上升至最大值,随后保持稳定;苹果消化产物在4h时上升到最大值.经过分析对比之后可以发现,西瓜在模拟消化后,由羟基清除表现出的还原能力:肠消化大于胃消化;而苹果则为胃消化大于肠消化.

羟自由基(·OH)是在生命活动代谢中源源不断地产生的,活性氧自由基可占人体内自由基总量的95%以上,而且在所有的活性氧自由基中·OH的氧化力最强,反应速度最快,很容易将糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质氧化,对机体氧化还原稳态产生不良影响,同时也对细胞的正常功能有一定的损害[19,20].

通过模拟胃液的强酸环境,对氢键的稳定性造成破坏,进而使酚类得到释放,所以胃消化组的清除羟自由基的能力是大于肠消化组的.

虽体外消化模型依据的是人体胃肠道而进行构建的,但在准确真实地反映体内消化状况这一方面还存在局限性,同时西瓜及苹果的组分复杂,存在多种有机物.因此,借助体内消化系统来研究这两者在人体胃肠道消化环境中抗氧化活性等是如何变化的是十分必要的.此外,对抗氧化活性进行评价的方法很多不一而足,但结合本次研究结论以及相关文献报道,发现对同一组分用不同的评价方法得出的的结论并不完全一致,所以在研究抗氧化能力时选取不同方法进行综合评价是不可或缺的.

3、结论

本文研究了在体外模拟胃肠消化过程中西瓜及苹果抗氧化活性的变化规律,结果表明,模拟胃消化可提高西瓜和苹果的抗氧化活性,且在模拟胃肠消化中,抗氧化活性在消化0.5～1h内升高,约在消化1h或2h后达到最大值,然后逐渐下降,抗氧化活性在肠胃消化后升高.目前,关于活性成分的研究,传统的体外化学法主要是采用化学溶剂提取活性成分,对其进行测量,虽然研究结果具有一定的科学价值,但是由于机体的复杂环境,人体内的复杂反应并不是简单的化学模拟,因此,体外消化模型仍需不断改进提高,以期望更加真实的反映人体的消化系统.本次研究结果将为西瓜及苹果的深度开发和增值加工提供新的理论依据.

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