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探究如何建立rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺

2020-06-18 483 上传者：管理员

摘要：目的建立长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的纯化工艺。方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后，再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、QHP阴离子交换层析进行纯化，同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、QHP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4mg，纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%，宿主蛋白残留量分别为2500、864和71ng/mg，宿主DNA残留量分别为329、0.56和0.12ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5、3.2和0ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300，等电点范围为5.56.5，可与鼠抗人生长激素抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺，该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高，本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。

关键词：
hGH基因
抗体Fc段
生物化学
纯化
融合蛋白
质量检定
重组人生长激素
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人生长激素由人脑垂体前叶腺嗜酸性粒细胞释放，含有191个氨基酸分子，其生理功能主要为促进身体各组织、器官及骨骼中受体细胞的蛋白质合成和脂肪分解，从而调节机体代谢和生长发育。主要的临床适用证为儿童生长激素缺乏症、严重烧伤、Tumer综合征等[1]。目前市场上的hGH大多半衰期较短，为达到理想的治疗效果，需要较高给药频率或剂量，给患者带来了较大的痛苦及经济负担。因此，延长hGH半衰期显得尤为重要。目前，国内外在研的长效hGH主要有化学修饰、生物可降解微球缓释体系、融合蛋白等[2,3,4,5]。

重组人生长激素-Fc融合蛋白是将hGH基因与经改造的人抗体Fc段连接，并克隆至GS双表达载体，稳定转染CHO-k1细胞筛选后，经罐培养、纯化获得[6]。本研究采用Protein-A亲和层、阳离子层析、阴离子层析建立rhGH-Fc融合蛋白的3步纯化工艺，并进行相应质量检定，为大规模生产rhGH-Fc融合蛋白奠定基础。

1、材料与方法

1.1细胞培养液

罐培养的rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液由长春生物制品研究所细胞因子室制备。

1.2主要试剂及仪器

CHOHCPELISAKit及Protein-AELISAkit购自美国Cygnus公司；CHODNA检测试剂盒购自湖州申科生物技术有限公司；高相对分子质量marker及低相对分子质量marker购自宝生物工程（大连）有限公司；彩色预染蛋白质分子量标准购自碧云天生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG购自美国Invitrogen公司；鼠抗hGH抗体由长春生物制品研究所细胞因子室制备；DAB显色试剂盒（20×）购自北京索莱宝科技有限公司；ATProtein-ADiamond层析介质及QBestaroseHP层析介质购自上海博格隆生物有限公司；CMSepharoseFastFlow层析介质、26/200层析柱及AKATApurifier100购自美国GE公司；高效液相色谱仪购自美国PerkinElmerFlaxer公司；分子尺寸排阻色谱柱TSK3000SW购自日本TOSOH公司；成像毛细管等电聚焦电泳仪及μSIL-FC毛细管柱购自荣捷生物工程有限公司。

1.3细胞培养液预处理

将rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经175×g离心10min，弃沉淀，收集上清，11224×g离心30min，弃沉淀；上清液中加入200mmol/L氯化钠，待其完全溶解后，用1mol/L醋酸调节pH至5.0,4℃静置20min;11224×g离心30min，用1mol/LTris调节pH至7.4；经0.45μm膜过滤，超滤浓缩2～3倍[7]。

1.4高度纯化

1.4.1Protein-A亲和层

用含150mmol/L氯化钠的50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）平衡ATProteinADiamond层析柱，平衡10～15个柱体积。上样量为20～25mg/mL（蛋白质/介质），用含300mmol/L氯化钠的20mmol/L柠檬酸缓冲液（pH4.5)[7,8]连续淋洗5个柱体积，再以20mmol/L柠檬酸缓冲液（pH4.5）淋洗1个柱体积。用20mmol/L柠檬酸缓冲液（pH3.6）洗脱蛋白，根据波长280nm的紫外吸光值收集目标蛋白，收样的同时用1mol/LTris调节pH至中性。

1.4.2阳离子层析（CM)

CMSepharoseFastFlow阳离子层析柱用20mmol/L柠檬酸缓冲液（pH6.0）平衡10个柱体积后上样，亲和层析后的蛋白样品上样量为100～200mg/mL（蛋白质/介质），根据波长280nm的紫外吸光度值收集流穿液目标蛋白[9]。收样的同时用1mol/LTris调节pH至8.0。

1.4.3阴离子层析（QHP)

QBestaroseHP阴离子层析柱用10mmol/LTE缓冲液（pH8.0）平衡10～15个柱体积后上样，阳离子层析后的蛋白样品上样量为10～15mg/mL（蛋白质/介质），淋洗液为10mmol/LTE缓冲液（pH8.0），连续淋洗5个柱体积。用含有160mmol/LNaCl的20mmol/LTE缓冲液（pH8.0）进行梯度洗脱，根据波长为280nm的紫外吸光度值收集目标蛋白[9]。

1.5纯化产物的检定

1.5.1蛋白含量检测

采用《中国药典》三部（2015版）[10]通则0731Lowry法对各步纯化产物进行蛋白含量测定。

1.5.2SEC-HPLC纯度分析

采用SEC-HPLC法对各步纯化产物进行纯度检测。色谱柱选用TSK3000SW，流动相为含有0.3mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液（pH6.8），上样量为100μL，流速为0.6mL/min，检测波长为280nm，检测时间设为22min。

1.5.3SDS-PAGE分析

将QHP阴离子纯化产物进行还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳[11]，分离胶浓度分别为12%和8%。

1.5.4Westernblot分析

将QHP阴离子纯化产物经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜，用含10%新生牛血清的TTBS缓冲液于室温封闭1h；加入鼠抗hGH抗体（1∶500稀释），于室温作用3h；用TTBS缓冲液洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶10000稀释），于室温作用1h;DAB显色。

1.5.5毛细管等电聚焦检测

采用毛细管等点聚焦电泳检测QHP阴离子纯化产物的等电点范围。选用μSIL-FC毛细管柱，检测波长为280nm，上样量为25μL，进样器温度为室温，预聚焦电压为1.5kV，持续1min，聚焦电压为3kV，持续6min。样品总体积为200μL，其中甲基纤维素终浓度为0.35%，载体两性电解质为4%，样品终浓度为0.4mg/mL，尿素为8mol/L,PI标准品为1%。

1.5.6rhGH-Fc蛋白相关杂质的检测

分别采用CHOHCPELISAKit试剂盒、CHODNA检测试剂盒及Protein-AELISAkit试剂盒对各步骤纯化产物的宿主残留蛋白、宿主残留DNA、残留Protein-A含量进行检测。

2、结果

2.1rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量

rhGH-Fc融合蛋白的3步层析图谱见图1。Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、QHP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4mg，回收率分别为97%、91%、70%，见表1。

图1rhGH-Fc融合蛋白纯化层析图谱

A:Protein-A亲和层析；B:CM阳离子交换层析；C:QHP阴离子交换层析。

表13步纯化工艺中目的蛋白回收率

2.2rhGH-Fc融合蛋白的SEC-HPLC纯度

Protein-A亲和层析、CM阳离子层析和QHP阴离子层析纯化样品的SEC-HPLC纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%，见图2。

图23步层析纯化样品的SEC-HPLC检测结果

注：图中+P为开始峰积分，-P为放开峰积分；数字1、2、3为积分峰。

2.3rhGH-Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析

QHP阴离子纯化rhGH-Fc蛋白经非还原和还原聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，相对分子质量分别约97300和49500，大小均与理论值相符，见图3。

图3rhGH-Fc融合蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

A：非还原聚丙烯酰胺凝胶（1:rhGH-Fc融合蛋白；M1：高相对分子质量marker);B：还原聚丙烯酰胺凝胶（M2：低相对分子质量marker;M1：高相对分子质量marker;1:rhGH-Fc融合蛋白）。

2.4rhGH-Fc融合蛋白的Westernblot鉴定

QHP阴离子纯化产物可与鼠抗GH抗体发生特异性结合，于相对分子质量约97300处可见特异性结合条带，见图4。

图4QHP阴离子纯化产物的Westernblot鉴定

1:rhGH-Fc融合蛋白；M：彩色预染蛋白质分子量标准。

2.5rhGH-Fc融合蛋白的等电点

QHP阴离子纯化产物的等电点范围为5.5～6.5，见图5。

2.6rhGH-Fc融合蛋白相关杂质的检测结果

Protein-A亲和层析、CM阳离子层析和QHP阴离子层析纯化样品的宿主残留蛋白分别为2500、864、71ng/mg，宿主残留DNA分别为329、0.56、0.12ng/mg，残留Protein-A含量分别为24.5、3.2、0ng/mg。

图5rhGH-Fc融合蛋白毛细管等点聚焦电泳图谱

3、讨论

融合蛋白药物生产过程中会产生许多影响产品质量的杂质，主要包括聚体、宿主残留蛋白、宿主残留DNA、脱落的Protein-A、内毒素等。本实验中，由于采用CHO细胞表达外源蛋白，残留宿主细胞蛋白、宿主残留DNA及在蛋白纯化过程中引入的Protein-A杂质是影响产品质量的主要原因。目前Protein-A亲和层析作为第1步抗体及Fc融合蛋白捕获阶段仍为最为有效的方法，在抗体及Fc融合蛋白纯化工艺中占主导地位。

本研究以Protein-A亲和层析作为纯化工艺第1步，其洗脱液中仅含有少量的高分子聚合物、宿主残留蛋白、残留DNA、Protein-A等杂质，蛋白纯度可达95.7%。根据相关文献报道，CHO宿主残留蛋白大多数等电点范围在4.5～7.0之间[12,13]，根据目的蛋白与宿主蛋白等电点的差异，在亲和层析后，采用阳离子和阴离子层析进行进一步纯化[14]，由于rhGH-Fc蛋白在酸性条件下不稳定，易产生沉淀，因此选用阳离子流穿模式进行纯化，试验结果表明，阳离子交换层析虽在提高纯度方面效果不明显，但可有效去除宿主残留蛋白、残留DNA、Protein-A，再经阴离子层析，可最大程度去除宿主残留蛋白、宿主残留DNA、Protein-A、聚合体。

本研究成功建立了rhGH-Fc融合蛋白纯化工艺，经3步纯化后样品纯度达99%以上，蛋白回收率达60%以上，宿主残留DNA含量为0.12ng/mg，宿主残留蛋白含量低于100ng/mg,Protein-A蛋白含量为0，毛细管电泳检测到目的蛋白等电点范围为5.5～6.5，与理论值一致，且纯化蛋白可与GH抗体发生特异性结合，表明蛋白正确。采用本实验建立的纯化工艺获得的rhGH-Fc融合蛋白回收率及纯度均较高，为大规模生产该蛋白奠定了理论基础。

参考文献:

[1]包建华.重组人生长激素的临床应用进展[J].药学服务与研究,2008(4):272-275.

[2]唐姝,陈志祥,陆伟根.重组人生长激素长效制剂的研究进展[J].世界临床药物,2014,35(1):36-41.

[6]俞露,刘玉林,申兆兴,等.rhGH-Fc工程细胞的构建及筛选[J].中国生物制品学杂志,2016,29(10):1021-1026.

[7]陈泉,卓燕玲,许爱娜,等.蛋白A亲和层析法纯化单克隆抗体工艺的优化[J].生物工程学报,2016,32(6):807-818.

[10]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:788.

[11]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].3版.黄培堂.译.北京:科学出版社,2002.

郭胜苍,俞露,富瑞丽,王莹,刘玉林,张宇,王江林,刘涵.长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):705-708+713.

基金:吉林省重点科技攻关项目(20160204034YY).