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论Cu,Zn-SOD突变体的酶活性测定与原核表达、纯化

2020-06-18 598 上传者：管理员

摘要：目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD）突变体，并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中，构建重组表达质粒SOD1-pET-28a，转化入大肠埃希菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达；在500mL摇瓶培养条件下，通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件；表达的重组蛋白经初步纯化后，测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为15000，主要以可溶性形式表达；工程菌株在500mL摇瓶培养条件下培养至10h左右，A（600）至3.5左右时加入终浓度为0.1mmol/LIPTG、0.2mmol/LZnCl2、0.5mmol/LCuSO4，可获得最佳表达量（29.2%）；初步纯化获得的重组蛋白纯度为97.32%，比活为5.08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体，初步纯化的突变体具有较好的酶活性，为进一步摸索大规模生产工艺及实际应用奠定了基础。

关键词：
原核表达
大肠埃希菌表达系统
层析
生物化学
酶活性
铜锌超氧化物歧化酶
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超氧化物歧化酶是一种广泛存在于生物体内的金属酶，其可将底物超氧阴离子自由基催化为过氧化氢和氧气，是唯一一种能够特异性清除超氧离子自由基的抗氧化酶，在生物体的抗氧化、抗逆生物活动中起重要作用，为生物体抗氧化系统的第一道防线[1,2]，广泛应用于医药、食品、农业、化妆品等领域[3,4,5,6,7,8]。动物来源的SOD价格昂贵，且使用存在潜在的安全隐患；植物来源的SOD来源广泛，使用安全性高，但原料使用量大，提取工艺复杂；而基因重组法制备SOD具有产量高、无有害物质残留及感染病毒风险、使用安全等优点。

SOD根据所含金属辅基的不同，分为铜锌超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD）、Fe-SOD及Mn-SOD，其中Cu,Zn-SOD存在于真菌、动植物的真核细胞以及部分原核生物中；Fe-SOD存在于部分原核生物内，如E.coli和Methanobacteriumbryanti;Mn-SOD存在于真核生物细胞线粒体和部分原核生物内。在这3种SOD种，Cu,Zn-SOD在生物体内含量最高，且具有较好的稳定性，使其具有更好的应用前景[9,10,11]，但天然Cu,Zn-SOD分子对环境因素敏感，半衰期短，易失活。有研究表明，通过热力学分析，定点突变SOD分子个别氨基酸残基，可增加其亚基结合稳定性和酶分子的热稳定性，获得热力学稳定的酶突变体[12,13]。本研究原核表达、纯化经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体，并检测其酶活性，旨在进一步开发一种较为经济的Cu,Zn-SOD来源。

1、材料与方法

1.1质粒及菌株

含Cu,Zn-SOD突变基因的SOD1-T质粒由长春生物制品研究所生物技术研究室迟春萍研究员提供，由其完成突变基因的设计及合成[SOD1为参照NCBI中番茄Cu-ZnSOD2(NP-00123-4031.2）中介绍的SOD序列，通过热力学分析，将SOD第19位亮氨酸残基（L）突变为异亮氨酸残基（I），第49位亮氨酸残基（L）替换为谷氨酰胺残基（W），以提高其亚基结合的稳定性及酶蛋白的热稳定性]；pET-28a载体和感受态E.coliBL21(DE3）均购自日本TaKaRa公司。

1.2主要试剂及仪器

限制性内切酶NdeⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶、DNAmarkerDL2000、DNAmarkerDL15000、质粒DNA小量提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒均购自日本TaKaRa公司；Phusion高保真DNA聚合酶购自美国NEB公司；Cu,Zn-SOD活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；阴离子交换介质DEAE-SepharoseFF购自美国GE公司；其他试剂均为国产试剂；MJMini基因扩增仪、电泳系统和GelDocRX凝胶成像系统均购自美国BIO-RAD公司；AH100B高压匀质机购自加拿大ATS公司。

1.3Cu,Zn-SOD基因的扩增

根据GenBank中登录的番茄Cu,Zn-SOD基因序列（NM-001311084.1），使用VectorNTI9.0软件设计引物，上游引物序列：5′-CTACCATATGGTGAAGGCCGT-3′（下划线部分为NdeⅠ酶切位点），下游引物序列：5′-CATAAGCTTC-CGCCTTTGA-3′（下划线部分为HindⅢ酶切位点），扩增片段大小485bp。引物由宝生物工程有限公司合成。以SOD1-T质粒为模板，PCR扩增Cu,Zn-SOD突变体基因片段，反应条件为：95℃预变性5min;95℃变性30s,63℃退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min。PCR产物送宝生物工程有限公司测序。

1.4重组表达质粒的构建

用NdeⅠ和HindⅢ双酶切经测序确认正确的PCR产物和pET-28a载体，回收目的基因片段和载体片段，以T4DNA连接酶连接，获得重组表达质粒SOD1-pET-28a，转化感受态E.coliDH5α，提取质粒，双酶切鉴定，测序后进行BLAST分析。

1.5重组蛋白的诱导表达及可溶性分析

将阳性重组表达质粒SOD1-pET-28a转化入感受态E.coliBL21(DE3）中，制备重组工程菌株SOD1-BL21(DE3），按1%接种量接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养至A600约为0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG、0.1mmol/L的ZnCl2和0.1mmol/L的CuSO4，继续诱导培养3h。离心收集菌体，用水重悬后沸煮法裂解菌体，离心，分别收集上清及沉淀，进行15%SDS-PAGE分析，并通过SOD活性电泳对表达蛋白进行鉴别确证[14]，以未诱导表达的工程菌为对照。

1.6重组蛋白诱导表达条件的优化

将工程菌株接种于500mL摇瓶中培养24h，每小时取培养液检测菌体密度（A600），绘制生长曲线，确定添加诱导剂（0.1mmol/LIPTG）的时间及诱导时间。诱导表达时加入不同剂量的酶所需要的Cu/Zn金属离子（金属离子对工程菌细胞具有一定毒性），见表1，检测目的蛋白表达量，确定最佳添加剂量。

1.7表达产物的初步纯化及活性测定

将诱导表达后的菌液，离心收集菌体沉淀，用等体积pH7.5的20mmol/LPB溶液重悬，高压匀质破碎菌体，离心，收集上清液，经阴离子交换介质DEAE-SepharoseFF纯化，平衡液为pH7.5的20mmol/LPB，洗脱液为150mmol/L氯化钠溶液，获得rhCu,Zn-SOD初步纯化产物，利用Cu,Zn-SOD活性检测试剂盒测定其酶活性。

表1诱导表达时Cu、Zn离子添加剂量

2、结果

2.1Cu,Zn-SOD突变体基因扩增产物的鉴定

Cu,Zn-SOD突变体基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约500bp的特异性片段，大小与预期相符，见图1。测序结果与目标序列一致。

图1Cu,Zn-SOD突变体基因扩增产物电泳图

M:DNAmarkerDL2000;1:Cu,Zn-SOD突变体基因PCR产物。

2.2重组表达质粒的鉴定

重组表达质粒SOD1-pET-28a的双酶切（NdeⅠ/HindⅢ）产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约500bp的目的基因片段，见图2。经测序及BLAST分析，片段大小与目的片段核苷酸序列一致，表明重组表达质粒构建正确。

图2重组表达质粒SOD1-pET-28a的双酶切（NdeⅠ/HindⅢ）鉴定

M1:DNAmarkerDL2000;M2:DNAmarkerDL15000;1：重组表达质粒的双酶切产物；2：未酶切的重组表达质粒。

2.3表达产物的鉴定

表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约15000的目的蛋白条带，大小与预期一致，见图3。可溶性分析显示，表达条带主要集中于上清液中，见图4，表明重组蛋白主要以可溶性形式表达。经SOD活性电泳确定，表达的目的蛋白为SOD，见图5。

2.4重组蛋白诱导表达条件的优化

菌体培养3～13h时处于对数生长期，13h后生长处于平台期，至24h菌体A600略有下降，见图6。根据生长曲线，菌体生长至对数中期，即培养至10h左右，A600至3.5左右时加入IPTG及Zn、Cu离子进行诱导表达。诱导表达时加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG、0.2mmol/L的ZnCl2、0.5mmol/L的CuSO4，重组蛋白表达量最高（29.2%），见表2。

2.5纯化产物的鉴定

初步纯化产物经SDS-PAGE分析，纯度为97.32%，见图7；经检测，比活为5.08×103U/mg。

图3表达产物的SDS-PAGE分析

M：蛋白质marker;1：未诱导的重组菌；2：诱导的重组菌全菌体。

图4表达产物的可溶性分析

1：全菌体蛋白；2：离心上清；3：离心沉淀。

图5全菌体SOD活性电泳图

1：对照菌；2：工程菌。

表2诱导表达时不同Zu、Cn离子添加剂量对重组蛋白表达量的影响

图6500mL摇瓶中工程菌的生长曲线

图7初步纯化产物的SDS-PAGE分析

M：蛋白质marker;1：诱导表达的全菌体；2：初步纯化产物。

3、讨论

大肠埃希菌表达系统（原核表达系统）由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。大肠埃希菌遗传图谱明确，易培养且费用低，对许多蛋白质有很强的耐受能力，能高水平地表达这些蛋白质，而且较以哺乳动物细胞及酵母细胞为代表的真核表达系统，具有更容易获得工程菌株、工程菌株繁殖快速、培养液细胞密度高、目的蛋白产量高、易纯化等优点。但大肠埃希菌表达系统表达的蛋白质缺乏表达后的蛋白质修饰，如蛋白质的糖基化，从而影响部分蛋白质结构的形成以及性质。

本研究通过热力学分析番茄Cu-ZnSOD2，将SOD第19位亮氨酸残基（L）突变为异亮氨酸残基（I），第49位亮氨酸残基（L）替换为谷氨酰胺残基（W），以提高酶分子亚基结合的稳定性及酶蛋白的热稳定性[13,15]，成功构建了可表达具有酶活性的该突变体的大肠埃希菌工程菌株SOD-BL21(DE3）。通过SDS-PAGE及酶活性电泳确定了目的蛋白主要以可溶性方式表达，根据菌体生长曲线及加入Zn、Cu离子浓度的优化，确定在培养至10h左右，A600至3.5左右时加入0.1mmol/LIPTG、0.2mmol/LZnCl2、0.5mmol/LCuSO4，可获得最高表达量（29.2%）。经初步层析纯化获得纯度为97.32%，比活为5.08×103U/mg的Cu,Zn-SOD。本研究表达的Cu,ZnSOD突变体在原核表达系统中具有较好的酶活性，且该突变体经过了热力学优化突变，具有潜在的应用价值，也为进一步摸索大规模发酵生产工艺及该酶突变体的实际应用奠定了基础，但其与天然Cu,ZnSOD在功能以及安全性方面的差异还需进一步的研究及验证。

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基金:吉林省科学技术发展重点项目(20070924-02).