干扰素(interferon, IFN)是1957年科学家在研究鸡胚中病毒干扰现象时被发现的[1],是真核细胞响应病毒、微生物产物或化学诱导剂等刺激时而产生的天然糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用[2]。根据基因结构、功能特征及受体用途可将IFN分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型[3],γ干扰素(IFN-γ)是Ⅱ型IFN家族中的唯一成员，是一种多效性分子，具有调控细胞增殖和凋亡的作用[4]。IFN-γ的多效性功能是通过激活细胞内分子信号网络(主要是通过JAK/STAT途径[5])产生细胞特异性表达的IFN调节基因发挥的，IFN-γ与其异二聚体IFN-γ受体1(IFNGR1)/IFNGR2结合激活Janus激酶1(JAK1)和JAK2,导致信号转导及转录激活因子1(STAT1)磷酸化，磷酸化的STAT1同源二聚体入核后结合并激活一种称为γ激活位点(GAS)的独特DNA元件，从而诱导IFN刺激基因(ISGs)表达[6]。这些ISGs编码的蛋白质产物单独或协同工作，从而改变细胞状态以便在病毒复制周期的许多阶段起到防御病毒的作用[7]。

作为一种典型的原核表达系统，改造后的大肠杆菌因生长速度快、连续发酵能力强和成本相对较低，被广泛作为外源蛋白表达的细胞宿主，而外源蛋白的表达形式主要分为可溶性和包涵体两种[8]。陈忠广等[9]利用稀释复性法探讨了不同条件对重组犬IFN-γ(rCaIFN-γ)蛋白体外折叠的复性影响，最终得到活性为1.35×104U/mL、比活性为3.74×106U/mg的重组蛋白。秦海斌等[10]先构建pET-CaIFN-γ/BL21,然后以包涵体形式表达了重组蛋白rCaIFN-γ,经纯化复性后测得rCaIFN-γ在犬肾细胞(MDCK细胞)上抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性可达1.1×105U/mg, 且对犬流感病毒(CIV)具有明显的抑制作用。目前，尚未见到国内基于原核大肠杆菌表达系统表达可溶性重组蛋白rCaIFN-γ并研究其对犬类相关病毒作用的报道。鉴于此，本试验采用原核表达系统表达可溶性重组蛋白rCaIFN-γ,并研究其生物学活性，以期为研制新型犬类IFN-γ生物制剂用于犬类临床疾病的治疗奠定基础。

1、材料

1.1 载体、细胞株及菌毒株

pCold-SUMO-10His原核蛋白表达试剂盒，购自海基生物科技有限公司；MDCK细胞、过表达PB2蛋白的犬肾细胞[MDCK(PB2)细胞]、VSV、H3N2亚型CIV,均由中国兽医药品监察所提供；大肠杆菌DH5α(DE3)感受态细胞，购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要试剂

限制性内切酶Kpn Ⅰ-HF和Hind Ⅲ-HF,购自北京NEB公司；5 min快速T4 DNA连接酶、FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit Pro-BOX 2,购自诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖(REG ΜLAR AGAROSE G-10),购自北京中创宏达科技有限公司；Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)、电泳用DNA Marker、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Taq, 均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-IDA亲和层析柱，购自天地人和生物科技有限公司；氨苄西林、L-阿拉伯糖、氯霉素、PBS干粉、LB营养琼脂、LB肉汤、蛋白质分子质量标准、His Tag鼠源单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG,均购自北京索莱宝科技有限公司；盐酸四环素储存液，购自北京酷来搏科技有限公司；HA Tag鼠源单克隆抗体，购自武汉三鹰生物技术有限公司；SUMO蛋白，购自南京钟鼎生物技术有限公司；DMEM细胞培养基，购自美国Gibco公司；胎牛血清(FBS),购自杭州天杭生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒，购自MCE生物科技公司。

1.3 主要仪器

电泳仪(型号为DYY-6C),购自北京六一生物科技有限公司；梯度PCR仪(型号为C1000 Touch)、酶标仪(型号为iMark)、凝胶成像仪(型号为Universal Hood Ⅱ)等，均购自Bio-Rad公司；实时荧光定量PCR仪(型号为LightCycler 480 Ⅱ),购自德国Roche公司；超声波细胞破碎仪(型号为JY98-Ⅲ DN),购自宁波新芝生物科技股份有限公司；超灵敏多功能成像仪(型号为Amersham Imager 600),购自美国GE公司；CO2培养箱(型号为MCO-15AC),购自Panasonic公司。

2、方法

2.1 引物的设计与基因扩增

参照GenBank上的CaIFN-γ基因序列(登录号为NM_001003174.1),利用SignalP 4.0软件分析去掉N端信号肽，并在C端终止密码子前添加柔性linker——(G)n连接的HA标签。根据大肠杆菌密码子的偏嗜性和表达载体的酶切位点，在不改变蛋白质编码的前提下，对CaIFN-γ基因序列进行优化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成并连接至pUC57上构成重组克隆质粒pUC57-CaIFN-γ。基于重组克隆质粒上优化后的CaIFN-γ基因序列，利用SnapGene生物学软件设计特异性引物，并在引物的5′端分别加上保护性碱基(下画线部分)及Kpn Ⅰ-HF和 Hind Ⅲ-HF酶切位点(斜体部分),上下游引物序列为：5′-GGGGTACCCAGGCGATGTTCTTC-AAAGAAAT-3′和5′-CCCAAGCTTTTAAGCGTAAT-CTGGAAC-ATCG -3′,预扩增产物大小为494 bp。PCR扩增体系(总体积为25 μL):Premix Taq(2 ×)12.5 μL,上下游引物各1 μL,重组克隆质粒pUC57-CaIFN-γ 1 μL,RNase free ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s, 62 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环；72 ℃再延伸5 min; 4 ℃保存。

2.2 重组表达质粒pCold-SUMO-10His-CaIFN-γ的构建

用琼脂糖凝胶对以重组克隆质粒pUC57-CaIFN-γ为模板进行PCR扩增得到的产物进行电泳鉴定，胶回收后与表达载体pCold-SUMO-10His分别用限制性内切酶Kpn Ⅰ-HF和Hind Ⅲ-HF进行双酶切和纯化回收，回收产物于25 ℃连接5 min后转化至大肠杆菌DH5α(DE3)感受态细胞中，筛选单克隆菌落，然后进行菌液PCR、双酶切及测序鉴定。将鉴定结果均正确的阳性质粒命名为重组表达质粒pCold-SUMO-10His-CaIFN-γ。

2.3 重组蛋白rCaIFN-γ的表达鉴定与可溶性分析

将重组表达质粒pCold-SUMO-10His-CaIFN-γ转入表达菌株Lyophilized BL21(DE3) Chaprone(属于pCold-SUMO-10His原核蛋白表达试剂盒的)中，挑取单克隆菌落接入含100 μg/mL氨苄西林、20 μg/mL氯霉素的LB营养琼脂培养基中进行过夜扩大培养；再按照2%的比例接入新的含100 μg/mL氨苄西林、20 μg/mL氯霉素、0.5 mg/mLL-阿拉伯糖的LB营养琼脂培养基中，于37 ℃振荡培养2 h; 加入终浓度为2 ng/mL的四环素振荡培养至OD600值为0.6～0.8,待培养基冷却至15 ℃后再静置30 min; 加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG诱导剂，于15 ℃振荡培养过夜；诱导结束后4 ℃、4 000 r/min离心15 min; 收集菌体，超声裂解细菌，取上清液与沉淀分别进行SDS-PAGE与Western-blot检测。

2.4 重组蛋白rCaIFN-γ表达条件的优化和纯化

改变IPTG的浓度，分别用终浓度为0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mmol/L的IPTG进行诱导，超声破碎后取上清液进行SDS-PAGE分析比较。以选定的最佳IPTG浓度进行大量诱导表达，然后使用Ni-IDA亲和层析柱经梯度浓度(10,20,50,80,100,250,300,350,400,500,500,500 mmol/L)咪唑溶液纯化后透析至PBS中保存。

2.5 重组蛋白rCaIFN-γ的细胞毒性检测

采用CCK-8法测定rCaIFN-γ分别作用于MDCK与MDCK(PB2)细胞24 h后的存活率。待接种于96孔细胞培养板中的MDCK与MDCK(PB2)细胞生长至单层时，将纯化的rCaIFN-γ用含7% FBS的DMEM培养液进行2倍倍比稀释，共设置8个梯度，每个梯度6个重复孔，每孔100 μL,即试验组，同时设置细胞对照组(不加rCaIFN-γ)和空白对照组(不加细胞和rCaIFN-γ,只加PBS),置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h; 弃去DMEM培养液，按照CCK-8∶DMEM培养液=1∶10的比例向每孔加入两者的混合液110 μL,在5%CO2培养箱内孵育1 h后测定OD450值，然后计算细胞存活率并作图。

2.6 实时荧光定量PCR(相对定量)法检测rCaIFN-γ对凋亡相关基因表达的调节

将MDCK与MDCK(PB2)细胞接种于12孔细胞培养板中，待生长至单层时将重组蛋白rCaIFN-γ用含7% FBS的DMEM培养液稀释至最大安全浓度，做3个重复孔，每孔加入1.5 mL,即试验组，同时设置细胞对照组(不加rCaIFN-γ),置37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h和6 h; 收集细胞，按照RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA并反转录为cDNA,进行p53、Bcl2相关X蛋白(Bax)、IFNGR2、STAT1和干扰素调节因子1(IRF1)等凋亡相关基因的实时荧光定量PCR测定。实时荧光定量PCR扩增体系(总体积为20 μL):2×TB Green qPCR Premix Ex Taq 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 7.2 μL。实时荧光定量PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火30 s, 共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算凋亡相关基因的相对表达量。

2.7 细胞ISGs 转录水平的实时荧光定量PCR(相对定量)测定

将分别铺于6孔细胞培养板中的MDCK与MDCK(PB2)细胞置37 ℃、5%CO2培养箱中培养至单层后，加入最大安全浓度的重组蛋白rCaIFN-γ对两种细胞进行孵育(试验组),同时设置细胞对照组(不加rCaIFN-γ)。24 h后收集细胞，按照RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA并反转录为cDNA,进行干扰素诱导跨膜蛋白1(IFITM1)、抗黏病毒蛋白1(MX1)、干扰素诱导蛋白与四肽重复1(IFIT1)、干扰素刺激基因15(ISG15)、2′-5′寡腺苷酸合成酶1(OAS1)等ISGs转录水平的实时荧光定量PCR(相对定量)测定。实时荧光定量PCR的扩增体系、扩增程序及结果计算方法同2.6。

2.8 重组蛋白rCaIFN-γ抗VSV活性效价的测定

采用细胞病变(CPE)法测定重组蛋白rCaIFN-γ在MDCK与MDCK(PB2)细胞上抑制VSV增殖的效价。待接种于96孔细胞培养板中的两种细胞分别生长至单层时，将相同浓度的重组蛋白rCaIFN-γ和SUMO蛋白分别用含7% FBS的DMEM培养液进行3倍倍比稀释，共设置8个梯度，每个梯度6个重复孔，每孔100 μL,置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h; 弃去上清液，每孔加入100 μL用含3% FBS的DMEM培养液稀释至100TCID50的VSV病毒液，即重组蛋白rCaIFN-γ试验组和SUMO蛋白试验组，同时设置细胞对照组(不经任何处理)和病毒对照组(仅用VSV病毒液处理),当病毒对照组细胞病变达75%以上时判定结果，然后按照Reed-Muench法计算重组蛋白rCaIFN-γ抗VSV的效价，同时通过CCK-8法计算重组蛋白rCaIFN-γ对VSV的抑制率。

2.9 重组蛋白rCaIFN-γ抗CIV活性的测定

将6孔细胞培养板中的MDCK细胞培养至单层后，加入最大安全浓度的重组蛋白rCaIFN-γ对MDCK细胞进行孵育，即试验组，同时设置病毒对照组(仅用CIV病毒液处理),置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h; 弃去上清液，然后加入100TCID50CIV,72 h后观察细胞病变情况并反复冻融3次，收集病毒液，按照RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA并反转录为cDNA,采用程慧敏等[11]建立的H3亚型CIV的实时荧光定量PCR(绝对定量)方法进行病毒载量测定。实时荧光定量PCR扩增体系(总体积为25 μL):TB Green Premix Ex Taq 12.5 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 9.5 μL。实时荧光定量PCR扩增程序： 95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火30 s, 共40个循环。

2.10 数据的统计与分析

采用GraphPad Prism 8软件对试验数据进行整理，结果以“平均值±标准差”表示(n≥3),采用t检验对试验结果进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

3、结果与分析

3.1 CaIFN-γ基因的扩增

以重组克隆质粒pUC57-CaIFN-γ为模板进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果(见图1)可见一条大小为494 bp的条带，与预期大小相符。

图1CaIFN-γ基因的PCR扩增结果

3.2 重组表达质粒的鉴定

重组表达质粒pCold-SUMO-10His-CaIFN-γ经菌液PCR、双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳结果分别显示出大小为494bp和479bp的条带，与预期大小相符，见图2。测序结果进一步表明重组表达质粒pCold-SUMO-10His-CaIFN-γ构建成功。

图2重组表达质粒pCold-SUMO-10His-CaIFN-γ的菌液PCR与双酶切鉴定结果

3.3 重组蛋白rCaIFN-γ在大肠杆菌中的表达鉴定

将诱导表达后的菌液经超声破碎后进行鉴定和可溶性分析。分别取空载菌、未诱导表达菌和诱导表达菌的上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果显示，上清液和沉淀中均有一条35.1ku大小的蛋白质条带(见图3),与预期目的蛋白大小相符，故目的蛋白可以进行可溶性表达；经Western-blot验证，以His Tag鼠源单克隆抗体和HA Tag鼠源单克隆抗体作为一抗时，均可成功获得特异性目的蛋白，见图4。

图3重组蛋白的SDS-PAGE分析结果

图4重组蛋白的Western-blot鉴定结果

3.4 重组蛋白rCaIFN-γ表达条件的优化和纯化鉴定

经过不同终浓度的IPTG诱导，对破碎后的上清液进行SDS-PAGE分析比较，结果(见图5)显示，IPTG终浓度为0.05mmol/L时，条带的强度占比更大一些。经Ni-IDA亲和层析柱层析纯化后的SDS-PAGE分析结果(见图6)显示，目的蛋白在咪唑浓度为350mmol/L时开始被洗脱掉，在500mmol/L时可见纯度达90%以上的清晰条带。

图5不同浓度IPTG诱导重组蛋白表达的SDS-PAGE分析结果

图6纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析结果

3.5 重组蛋白rCaIFN-γ的细胞安全性分析

CCK-8试验结果(见图7)显示，重组蛋白浓度为20 μg/mL(对应的对数值为4.32)时，MDCK与MDCK(PB2)细胞的存活率分别为93.58%和92.21%。因此，rCaIFN-γ的最大安全浓度为20 μg/mL。

图7重组蛋白作用于细胞24h后的细胞活性分析结果

3.6 重组蛋白rCaIFN-γ对凋亡相关基因表达的调节

实时荧光定量PCR(相对定量)结果(见图8)显示：重组蛋白rCaIFN-γ分别作用MDCK细胞、MDCK(PB2)细胞4h和6h后，与细胞对照组相比，试验组MDCK与MDCK(PB2)细胞中促凋亡基因p53和Bax的相对表达量无显著变化(图8中未显示);IFNGR2基因相对表达量呈现较低水平，除重组蛋白rCaIFN-γ作用MDCK(PB2)细胞4h时试验组极显著低于细胞对照组(P<0.01)外，其他情况两组间差异不显著(P>0.05);除重组蛋白rCaIFN-γ作用MDCK(PB2)细胞6h时试验组STAT1基因相对表达量显著高于细胞对照组(P<0.05)外，其他情况STAT1和IRF1基因相对表达量试验组极显著高于细胞对照组(P<0.01)。重组蛋白rCaIFN-γ作用后，试验组MDCK细胞中，IFNGR2、STAT1和IRF1基因相对表达量6h略高于4h,但均差异不显著(P>0.05);试验组MDCK(PB2)细胞中，IFNGR2和IRF1基因相对表达量6h极显著高于4h(P<0.01),而STAT1基因相对表达量6h显著低于4h(P<0.05)。

图8凋亡相关基因相对表达量的显著性分析结果

3.7 ISGs转录水平的测定

以最大安全浓度(20 μg/mL)的重组蛋白rCaIFN-γ分别刺激MDCK和MDCK(PB2)细胞24h, ISGs转录水平的变化情况见图9。在MDCK细胞中，与细胞对照组相比，试验组IFITM1转录水平显著升高(P<0.05),MX1、IFIT1、ISG15、OAS1转录水平极显著升高(P<0.01);在MDCK(PB2)细胞中，与细胞对照组相比，试验组IFITM1和ISG15转录水平显著升高(P<0.05),MX1和IFIT1转录水平极显著升高(P<0.01),OAS1转录水平升高不显著(P>0.05)。对试验组两种细胞中5种ISGs的转录水平进行比较，MDCK细胞中5种ISGs的转录水平均极显著高于MDCK(PB2)细胞(P<0.01)。

图9ISGs转录水平的测定结果

3.8 重组蛋白rCaIFN-γ抗VSV效价的测定

经Reed-Muench法测定，重组蛋白rCaIFN-γ在MDCK细胞和MDCK(PB2)细胞中抗VSV的效价分别为6.4×105U/mL和0[对MDCK(PB2)细胞无作用，故未展示图片];SUMO蛋白在两种细胞中对VSV均无作用，见图10。CCK-8检测结果(见图11)显示，当重组蛋白rCaIFN-γ浓度≥0.027 μg/mL(对应的对数值为-1.57)时，抑制率大于75%。

图10重组蛋白rCaIFN-γ在MDCK/VSV系统中抗病毒活性的测定结果

图11不同浓度rCaIFN-γ在MDCK细胞中对VSV抑制率结果

3.9 重组蛋白rCaIFN-γ对CIV的抗病毒作用

结果见图12。

由图12可知，与病毒对照组比较，试验组CIV的病毒载量显著降低(P<0.05),说明重组蛋白rCaIFN-γ对CIV有一定的抑制作用。

图12 100TCID50CIV作用MDCK细胞后的病毒载量测定结果

4、讨论与结论

近年来，宠物行业的快速发展和病毒的不断进化使得犬类疾病成为了人们关注的热点问题，但是现有药物却往往无法满足现实所需，因此具有高安全性且作为目前常用的抗病毒感染和抗肿瘤的生物制品——rCaIFN-γ有一定的研发前景。在机体免疫调节和抗病毒感染过程中IFN-γ能够发挥重要作用，因此获得特异且具有足够生物活性的IFN-γ蛋白是研发IFN-γ抗病毒药物的基础[12]。本试验利用pCold-SUMO-10His表达载体获得了无需复性、具有天然生物活性的可溶性重组蛋白rCaIFN-γ。Western-blot鉴定结果表明，获得的重组蛋白rCaIFN-γ具有良好的反应原性。但CCK-8检测结果显示，重组蛋白rCaIFN-γ的最大安全浓度只达到20 μg/mL,这可能是由表达纯化过程中某些物质的残留引起的，所以还需进一步优化条件与操作。

众所周知，IFN-γ对细胞具有抑制、促凋亡和抗增殖的功能[13],但这些功能要受到细胞表面IFNGR2表达量多少的调控，高水平的IFNGR2膜表达可诱导STAT1的快速激活及高水平IRF1的表达，进而触发细胞凋亡程序；相反，低水平的IFNGR2膜表达只能缓慢激活STAT1,IRF1表达水平也低，并诱导细胞增殖[14]。韩阳等[15]应用SUMO表达系统高效、稳定、可溶地表达了SUMO-CaIFN-γ蛋白，该蛋白对MDCK具有明显抑制增殖、促进凋亡的作用，并且这种作用是通过p53途径发挥的。本试验发现，重组蛋白rCaIFN-γ作用于MDCK和MDCK(PB2)细胞后，促凋亡基因p53和Bax的相对表达量无显著变化，此结果与上述研究结果不同。经验证，发现两种细胞表面IFNGR2基因相对表达量均很低，由此导致STAT1活化缓慢、IRF1表达水平低，而这种现象的产生可能受细胞所处状态的调控[16]。

IFN的抗病毒作用是依赖其与细胞上相应的受体结合引起的IFN级联反应所转录的ISGs发挥的[17],并且不同IFN激活的ISGs种类不同，由此所产生的抗病毒效应亦不同[18]。本试验用外源重组蛋白rCaIFN-γ分别作用MDCK和MDCK(PB2)细胞24 h后测定IFITM1、MX1、IFIT1、ISG15、OAS1转录水平的变化，结果发现除试验组MDCK(PB2)细胞中OAS1的转录水平变化不显著外，其他ISGs与细胞对照组比较显著或极显著升高，且MDCK细胞中5种ISGs转录水平极显著高于MDCK(PB2)细胞，表明表达的外源性重组蛋白rCaIFN-γ具有抗病毒活性，为重组蛋白rCaIFN-γ抗病毒作用的进一步研究提供了依据。

MDCK/VSV检测系统是测定IFN活性的最传统的方法。MDCK(PB2)细胞是在MDCK细胞的基础上过表达了甲型流感病毒(IAV)的PB2蛋白，IAV的PB2蛋白对病毒复制至关重要，也是宿主范围的关键决定因素[19]。在测定下游ISGs转录水平后，在MDCK和MDCK(PB2)细胞上分别检测了重组蛋白rCaIFN-γ抵抗VSV的能力，结果表明，重组蛋白rCaIFN-γ只在MDCK细胞上对VSV存在抗病毒作用，且抗病毒活性为6.4×105U/mL。究其原因，可能与PB2蛋白降低了细胞对重组蛋白rCaIFN-γ的敏感性，一定程度上抑制了STAT1/STAT2和ISGs的激活有关[20],这也与上述ISGs转录水平的测定结果契合。单独作用的SUMO蛋白在两种细胞上均不具有抵抗VSV感染的作用，这一结果排除了SUMO蛋白的存在可能对抗病毒作用产生的影响。最后对重组蛋白rCaIFN-γ抗CIV的体外活性进行了研究，实时荧光定量PCR(绝对定量)结果显示，重组蛋白rCaIFN-γ在MDCK细胞上对CIV有显著抑制作用。但基于体外测定和蛋白质安全作用浓度的局限性，重组蛋白rCaIFN-γ在体内发挥抗病毒活性的能力如何还有待进一步深究。

本试验通过大肠杆菌原核表达系统表达出了可溶且具有良好生物学活性的重组蛋白rCaIFN-γ,操作简便、成本低，对今后犬类IFN-γ生物制品的进一步研发具有重要意义。

参考文献:

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基金资助:国家重点研发计划项目“动物疫病综合防控关键技术研发与应用”重点专项“兽用生物制品标准物质研制”(2022YFD1800600);

文章来源:李海珠,曹众达,刘妍,等.重组犬IFN-γ的原核表达及生物学活性研究[J].黑龙江畜牧兽医,2024,(21):1-9