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白藜芦醇对黄曲霉毒素B1致兔空肠氧化损伤的保护作用

2024-11-14 78 上传者：管理员

摘要：为了研究白藜芦醇(Res)对黄曲霉毒素B1(AFB1)诱导的兔空肠氧化应激的保护作用，本试验取21只40日龄的健康肉兔，随机分为对照组(饲喂基础饲粮)、AFB1组[饲喂基础饲粮+0.3 mg/(kg•bw) AFB1]和AFB1+Res组[饲喂基础饲粮+0.3 mg/(kg•bw) AFB1+30 mg/(kg•bw) Res]。饲喂对应饲粮21 d后，采用苏木精-伊红(H.E.)染色和过碘酸雪夫氏(PAS)染色，观察空肠形态结构的改变；使用试剂盒检测空肠组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示，AFB1组兔空肠绒毛断裂，顶端溶解；与对照组相比，AFB1组绒毛高度极显著下降(P<0.01)而隐窝深度极显著上升(P<0.01),绒毛高度与隐窝深度的比率(V/C)极显著下降(P<0.01),杯状细胞数量和黏液层厚度均显著下降(P<0.05);与AFB1组相比，AFB1+Res组肠道绒毛结构恢复，绒毛高度极显著上升(P<0.01),隐窝深度极显著下降(P<0.01),V/C极显著上升(P<0.01),杯状细胞数量和黏液层厚度均显著上升(P<0.05);与对照组相比，AFB1组GSH-Px和SOD活性均极显著下降(P<0.01),T-AOC显著下降(P<0.05),MDA含量极显著上升(P<0.01);与AFB1组相比，AFB1+Res组GSH-Px和SOD活性均极显著上升(P<0.01),T-AOC显著上升(P<0.05),MDA含量极显著下降(P<0.01)。结果表明，在饲粮中添加30 mg/(kg•bw) Res可提高空肠抗氧化能力，缓解AFB1诱导的兔空肠结构损伤，为临床缓解AFB1中毒提供理论依据。

关键词：
兔
氧化应激
白藜芦醇
空肠
黄曲霉毒素B1
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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是对养殖业最具威胁的霉菌毒素之一，存在于谷物、油籽、坚果和香料等多种农作物中。AFB1污染属于全球性食品安全问题[1-2]。肠道是AFB1进入机体后首先接触的生物屏障[3]。被AFB1污染的食物或饲粮进入机体后可使肠道内氧化和抗氧化系统失调，进而导致肠道结构损伤，严重影响肠道结构和功能的完整性[4-5],这不仅会降低营养吸收效率，影响动物生长发育，还可能导致胃肠道出血甚至死亡。

白藜芦醇(Resveratrol, Res)是一种具有抗氧化和抗炎等多种生理功能的多酚化合物，存在于葡萄和花生等植物中。近年来，Res被认为可以缓解多种病因所致肠道损伤[6]。研究发现，Res具有增强肠道屏障功能，可维持肠道通透性和菌群平衡，抑制肠道炎症反应，减轻肠道氧化应激，促进肠道细胞存活，抑制细胞凋亡和自噬等多种生物功能，进而改善肠道屏障结构和功能的完整性[7]。在缓解霉菌毒素损伤方面，Res已被证实可缓解脱氧雪腐镰刀菌烯醇导致的肠道氧化损伤、炎症和线粒体损伤，改善肠道微生物群，从而缓解霉菌毒素导致的肠道屏障损伤[8-9]。Res可下调AFB1所诱导的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)积累，并通过调节细胞凋亡和核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信号通路缓解AFB1所诱导的鸭肝脏氧化损伤[10-11]。然而，Res能否修复AFB1诱导的兔肠道屏障损伤目前未见报道。因此，本试验旨在探究饲粮中添加Res对AFB1诱导的兔肠道氧化损伤的保护作用，为缓解AFB1诱导的空肠氧化应激提供科学依据。

1、材料与方法

1.1主要试剂

白藜芦醇(≥98%)、苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin, H.E.)染色试剂盒、糖原过碘酸雪夫氏(Periodic acid-Schiff, PAS)染色试剂盒和4%多聚甲醛固定液，均购自北京索莱宝科技有限公司；黄曲霉毒素B1(≥98%),购自青岛普瑞邦生物工程有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)测定试剂盒(比色法)、总超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)测定试剂盒(WST-1法)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)检测试剂盒(ABTS法)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)测定试剂盒(TBA法),均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2主要仪器

生物组织烘片机、生物组织摊片机和切片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品；光学显微镜，日本Nikon公司产品；全波长酶标仪，美国Thermo公司产品。

1.3试验动物

21只40日龄健康肉兔，体重为(1 179.66±44.18) g,由青岛康大生物科技有限公司提供[生产许可证号：SCXK(鲁)2016—0002]。本试验经河南科技大学动物实验伦理委员会批准(批准号：20220301024)。

1.4试验方法

1.4.1试验饲粮处理

AFB1和甲醇按照1∶10比例进行溶解稀释，Res和无水乙醇以1∶50比例进行溶解稀释。将配制好的溶液均匀喷洒至饲粮上，使AFB1组兔每日可通过饲料摄入0.3 mg/(kg·bw) AFB1,AFB1+Res组兔每日可通过饲料摄入0.3 mg/(kg·bw) AFB1和30 mg/(kg·bw) Res,充分搅拌后，45℃烘干90 min。

1.4.2试验分组

将21只健康肉兔随机分为3个组，分别为对照组、AFB1组和AFB1+Res组。对照组饲喂基础饲粮，AFB1组饲喂基础饲粮+0.3 mg/(kg·bw) AFB1,AFB1+Res组饲喂基础饲粮+0.3 mg/(kg·bw) AFB1和30 mg/(kg·bw) Res,连续饲喂21 d。试验兔定量饲喂对应饲粮，自由饮水。

1.4.3样本采集和相关指标检测

试验结束后，耳缘静脉空气栓塞处死肉兔，在空肠起始端截取空肠肠管约3 cm,无菌生理盐水浸泡5次，去除肠内容物，于预先配置的4%多聚甲醛溶液中固定。将固定好的组织放入包埋盒中，冲去残留多聚甲醛，依次使用30%、50%、70%、85%、95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成5μm的石蜡切片。

1.4.4绒毛高度和隐窝深度的比率计算

使用H.E.染色试剂盒对石蜡切片进行H.E.染色，切片脱蜡至水，苏木素染液染色5 min,水洗，伊红染液染色1 min,常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。于光学显微镜下观察兔空肠的病理学变化，于20倍镜下随机选择视野，测量3根形态完整的肠绒毛。按公式(1)计算绒毛高度与隐窝深度的比率(Villus height to crypt depth ratio, V/C)。

V/C=H÷D (1)

式中，H为肠绒毛高度，D为隐窝深度。

1.4.5杯状细胞的统计和黏液层厚度的测量

使用糖原PAS染色试剂盒对石蜡切片进行PAS染色，切片脱蜡至水，PAS氧化剂处理5 min,流水冲洗5 min;滴加Schiff染液，染色10 min,流水冲洗5 min;苏木素复染，分化、水洗，返蓝、水洗；常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。于20倍镜下随机选择3个视野，统计视野中完整的杯状细胞数量；在20倍镜下选择3根完整的肠绒毛，随机测量3个部位的黏液层厚度。

1.4.6氧化应激相关指标的检测

将剩余空肠制成组织匀浆液后，按照试剂盒说明书操作对GSH-Px和SOD活性、T-AOC以及MDA含量进行检测。

1.5数据分析

所有数据经SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用t检验，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。试验结果以“平均值±标准差(Mean±SD)”的形式表示。

2、结果

2.1 Res对AFB1致兔空肠形态结构变化的影响

兔空肠病理学观察结果如图1所示，对照组肠绒毛完整，排列有序，无脱落现象，无炎性细胞浸润；AFB1组可见肠绒毛断裂，顶端出现溶解，黏膜上皮结构破坏，上皮细胞排列不整齐；AFB1+Res组肠绒毛组织结构较AFB1组明显改善。

图1兔空肠形态结构观察(H.E.染色)

如图2所示，与对照组相比，AFB1组兔空肠绒毛高度极显著下降(P<0.01),隐窝深度极显著上升(P<0.01),V/C极显著下降(P<0.01);与AFB1组相比，AFB1+Res组绒毛高度极显著上升(P<0.01),隐窝深度极显著下降(P<0.01),V/C极显著上升(P<0.01)。

图2兔空肠绒毛高度和隐窝深度及其比率

如图3所示，与对照组相比，AFB1组兔空肠绒毛中杯状细胞数量下降，黏液层厚度下降；而AFB1+Res组均有所回升。具体结果如表1所示，与对照组相比，AFB1组兔空肠绒毛中杯状细胞数量和黏液层厚度均显著下降(P<0.05);在饲粮中添加Res后，杯状细胞数量和黏液层厚度均较AFB1组显著上升(P<0.05)。

图3兔空肠形态结构观察(PAS染色)

表1兔空肠杯状细胞数量和黏液层厚度

2.2 Res对AFB1致兔空肠氧化应激的影响

如图4所示，与对照组相比，AFB1组空肠GSH-Px活性和SOD活性均极显著降低(P<0.01),T-AOC显著下降(P<0.05),MDA含量极显著上升(P<0.01);与AFB1组相比，AFB1+Res组GSH-Px活性和SOD活性均极显著上升(P<0.01),T-AOC显著上升(P<0.05),MDA含量极显著下降(P<0.01)。

图4兔空肠氧化应激指标

3、讨论

肠道是机体消化吸收的主要场所，肠道结构的完整性与其功能密切相关。AFB1是一种剧毒的生物毒素，可诱导动物肠道损伤[5]。肠绒毛的高度和完整性大幅增加了肠道对饲粮的吸收面积，这与动物的消化吸收功能密切相关。肠隐窝深度代表了肠道细胞的成熟度，隐窝越浅表明肠道细胞成熟度越高，肠道功能更为完善。杯状细胞和黏液层是肠道化学屏障的重要组成成分，能促进食物的消化和吸收，并保护肠道黏膜免受其他致病因素的侵害。本试验结果显示，连续3周摄入含AFB1的饲粮可破坏兔空肠绒毛结构完整性，降低绒毛高度并增加隐窝深度，同时，AFB1还显著降低了肠绒毛中杯状细胞的数量和肠道黏液层的厚度，这与李庆豪[12]的研究结果一致。Res是一种天然多酚，已被应用于食品、药品和保健品等多种领域，被证实可改善多种原因所导致的肠道组织损伤[7,13]。本试验结果表明，在饲粮中补充Res可显著改善AFB1诱导的肠道结构损伤。

AFB1对肠道结构的损伤被认为与诱导氧化应激密切相关[14]。机体的抗氧化能力主要由SOD和GSH-Px等抗氧化酶提供。本试验结果显示，连续3周摄入含AFB1的饲粮可显著降低抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，以及机体T-AOC,显著提升MDA含量。MDA是脂肪酸和磷脂等在活性氧的作用下发生氧化反应所形成的，是反映组织氧化应激损伤的重要指标。这与Cheng等[15]研究结果一致，表明AFB1能诱导肠道氧化应激。Res具有显著的抗氧化功能，研究证实，Res可以缓解多种致病因素导致的鸭、猪和大鼠肠道氧化应激[16-19]。本试验结果显示，与AFB1组相比，Res+AFB1组肠道中SOD和GSH-Px活性极显著上升，T-AOC显著增加，机体脂质过氧化反应有所缓解，表明Res对AFB1所诱导的兔肠道氧化应激具有显著的改善效果。

本试验结果显示，饲粮中添加Res可改善AFB1诱导的兔肠道氧化应激，并缓解空肠结构损伤，为临床缓解AFB1中毒提供理论依据。

参考文献:

[12]李庆豪.猪β-防御素-2对黄曲霉毒素B1致肠道损伤的修复效果研究[D].郑州:河南农业大学,2022.

[17]符清瑶,施力光,周汉林,等.白藜芦醇对氧化应激仔猪回肠黏膜形态､抗氧化能力､紧密连接蛋白及炎性因子mRNA表达的影响[J].动物营养学报,2021,33(2):1163- 1172.

[18]马玉静,禹琪芳,杨玲,等.饲粮中添加不同剂量白藜芦醇对21日龄樱桃谷鸭生长性能､抗氧化能力及肠道健康的影响[J].动物营养学报,2020,32(8):3662- 3669.

[19]马升高,孙倩,郭保华.白藜芦醇对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜氧化应激水平及SIRT3表达的影响[J].解剖学研究,2019,41(1):35- 38+44.

基金资助:河南省重点研发与推广专项(202102110093);

文章来源:常陈昊,张自强,陈晓光,等.白藜芦醇对黄曲霉毒素B1致兔空肠氧化损伤的保护作用[J].中国兽医杂志,2024,60(11):19-23.