当前多羔是世界养羊业共同追求的目标，有研究表明养羊收入增加的25%来自产多羔[1]。在现代化畜牧业发展过程中，多羔性状发挥着重要作用，但多羔也带来了诸如羔羊成活率低、母羊钙质缺乏乃至瘫痪等问题，严重影响与限制了多羔经济效益的发挥。多羔母羊妊娠期的健康与其生产性能和繁殖性能关系密切。在多羔母羊妊娠后期，由于日粮结构改变及胎儿增重，母羊激素水平、代谢状态及免疫机能都会出现较大波动，从而增加酮症、炎症性疾病及产前瘫痪等风险[2]。代谢组学是一门探究疾病成因、反映生物标志物、描述疾病及监测和预测复杂疾病的学科，其中包括对机体整体水平上代谢物变化进行定性或定量分析[3]。代谢组学分为两类，一类是基于非靶向方向的代谢组学，另一类则是基于靶向方向的代谢组学[4]。目前，国内外对产前不健康羊只的诊断主要依赖临床医生的经验。相较于传统的血液生化指标，采用血液代谢组学表征的小分子物质能够更加全面、系统地反映宿主的生理健康状况，同时由于代谢组学具有快速、简便等特点，被广泛应用于动物血液代谢物的筛选[5]。国内外学者也开展了一些羊血液代谢标记物筛选方面的相关研究。Zhang J.Z.等[6]通过非靶向代谢组学分析了绵羊血清代谢物，结果发现过度放牧组血清中天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶活性及总胆红素、血清尿素氮含量均呈现显著升高的趋势。S.V.Thangaraj等[7]通过非靶向代谢组学分析了妊娠中期母羊血浆代谢物，结果发现生物固体暴露组血浆中脂质储存增加及脂肪酸氧化紊乱。A.Lisuzzo等[8]运用核磁共振(NMR)光谱技术对产后高酮血症母羊的代谢情况进行了分析，结果表明，高酮血症母羊血清3-甲基组氨酸含量显著增加，而苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和组氨酸含量则显著降低，产前检查时，针对不同日龄的绵羊，可以利用这些代谢物间存在的显著差异为临床诊断提供指导。然而，目前对于多羔羊妊娠期血液代谢组变化规律的相关研究报道甚少。多胎妊娠过程中由于多个胎儿的生长，使得胎儿对营养物质吸收增加，导致母体能量消耗增大，将会影响集约化养殖的接羔数和场区的经营。因此，本研究采用高灵敏度、高选择性、高通量和覆盖深度广泛的非靶向代谢组-液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术，对多羔羊产前瘫痪和正常妊娠期母羊的血液代谢物进行检测和分析，旨在评估多羔母羊在妊娠期间血清代谢物的变化规律，为妊娠期多羔母羊营养调控和疾病预防提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 试验动物及分组

在内蒙古兴安盟扎赉特旗内蒙古杜美牧业生物科技有限公司选择同一品种临产前的多羔母羊18只，以8只产前瘫痪多羔母羊为试验组、10只健康妊娠多羔母羊为对照组，养殖模式为舍饲饲养，饲喂相同日粮，自由饮水，舔食矿物质舔砖。

1.2 样品的采集与处理

在2023年2月6日—3月7日晨饲前，分别抽取试验组和对照组羊颈静脉血，1 000×g离心15 min, 吸取上层血清并置于干冰中贮存。将血清送至杭州联川生物技术股份有限公司进行LC-MS检测。

1.3 主要试剂与仪器

甲醇、乙腈，均购自美国Fisher Chemical公司；甲酸，购自美国ACS公司；高分辨串联质谱仪，购自美国AB Sciex公司；离心机，购自德国艾本德公司；天平，购自德国Sartorius公司。

1.4 代谢物的提取

取血清复温到室温后，每只羊取20 μL放入EP 管，随后分别加入50%甲醇120 μL,充分振荡混匀后即得代谢物，于常温静置10 min; 为了更好地沉淀蛋白质，将提取到的代谢物于-20 ℃过夜；4 000 r/min离心20 min; 吸取上清液转移到96孔细胞培养板中，各取出10 μL代谢物培养液混合成质控样品，于-80 ℃保存，备用。随后对所提取的样品进行随机上机排序检测，在样品前、中、后分别插入质控样品作为试验技术重复评估，样品分别在正负离子模式下进行质谱扫描检测，结果用于构建代谢物总离子图谱。

1.5 液相和质谱参数描述

液相参数描述：采集时，柱温为35 ℃,流速为0.4 mL/min。流动相的组成：A相为0.1%甲酸溶液，B相为含有0.1%甲酸的乙腈溶液。在时间为0～0.5 min时，流动相B为5%乙腈；在时间为>0.5～7 min时，乙腈含量逐渐增加，从5%增加到100%;在时间为>7～8 min时，流动相为100%乙腈；在时间为>8～8.1 min时，乙腈的含量开始逐渐减少，从100%降至5%;在时间为>8.1～10 min时，流动相B为5%乙腈。

质谱参数描述：采用高分辨串联质谱仪检测柱上洗脱的代谢物。在正离子模式下运行时，离子源电压浮动设置为5 000 V;在负离子模式下运行时，离子源电压浮动设置为-4 500 V。气帘气设置为30 PSI(1 PSI=6.89 kPa),离子源气1和离子源气2设置为60 PSI,接口加热器的温度为500 ℃。质谱数据采用IDA模式，运行时间质谱的质量范围为60～1 200 u。测量扫描在150 ms内获得，每秒不超过100计数的阈值，动态排除设置为4 s。在采集过程中，每18个样品进行一次质量精度的标定。此外，为评估LC-MS在整个采集过程中的稳定性，每隔9个样品采集一个质控样品。

1.6 数据处理与分析

1.6.1 代谢物鉴定

利用XCMS软件处理得到的信息，先利用开源软件metaX对物质的质荷比(m/z)与KEGG数据库进行匹配得到一级代谢物鉴定结果，由于存在不同物质具有m/z相近的情况，鉴定结果会出现一个m/z对应多个代谢物的现象，因此再利用in-house二级质谱图谱库，与代谢物二级质谱数据进行匹配，从而得到可信度更高的代谢物鉴定结果。

1.6.2 代谢物的定量分析

利用XCMS软件对每个物质在不同样品中的信号强度信息进行提取并使用开源软件metaX进行质控：先去除低质量峰(质控样品中缺失超过50%,或者实际样品中缺失超过80%),随后采用KNN(K-nearest neighbors)方法进行缺失值填补，接着采用PQN(probabilistic quotient normalization)和QC-RSC(QC-robust spline batch correction)进行数据归一化。此外，计算所有质控样品中代谢特征的相对标准偏差，并去除>30%的代谢特征。

1.6.3 差异代谢物的筛选

采用单变量分析(Student’t检验)和多变量分析比较试验组和对照组之间的代谢物差异，主要包括差异倍数值(fold-change)检测、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和变量重要性投影值(VIP)测量等。当差异代谢物VIP≥1,P<0.05,差异倍数≥2为上调差异代谢物；VIP≥1,P<0.05,差异倍数≤0.5为下调差异代谢物。

2、结果与分析

2.1 质控分析

结果见122页彩图1和123页彩图2。

由122页彩图1可知，在正、负离子模式下曲线重叠性高，表明整体质谱信号强度较好，在整个试验过程中仪器较为稳定。由123页彩图2可知，在9 min 之内注释到了大量的差异代谢离子。

图1血清代谢物总离子(TIC)

图2不同保留时间的代谢物m/z分布

2.2 代谢物的PCA

对鉴定到的代谢物进行PCA,结果(见图3)PC1可以解释原始数据集特征的25.68%,PC2可以解释原始数据集特征的16.40%,两组间样品分离明显，表明两组样品存在差异。

图3血清代谢物的PCA

Fig.3PCA of serum metabolites

2.3 代谢物的PLS-DA分析

建立PLS-DA模型进一步验证代谢物在两组之间的差异，结果试验组和对照组的主成分模式分离显著，无重叠现象(见图4A);对该模型参数R2和Q2进行置换检验，结果(见图4B)显示差异代谢物的R2Y值均高于Q2Y值，且Q2与Y轴的截距小于0,说明样品数据描述良好，没有过拟合现象，两组样品检测结果之间存在差异。

图4血清代谢物的PLS-DA

2.4 血清差异代谢物的筛选

与代谢物二级质谱数据进行匹配共注释了3 844个代谢离子。两组妊娠多羔母羊血清样品间共筛选出197种差异代谢物，其中显著上调差异代谢物有105种(P<0.05),主要包括1种乙酰乙酸、22种酰基肉碱等代谢物；显著下调差异代谢物有92种(P<0.05),主要包括39种溶血磷脂酰胆碱、9种溶血磷脂酰乙醇胺、4种溶血磷脂酰肌醇等代谢物。这些差异代谢物可影响母羊妊娠状态，是监测母羊妊娠期不同体况的指标。对每个筛选出的差异代谢物的强度值归一化后用热图(见124页彩图5)展示，从中可以看出差异物质在不同样品中的表达情况，绘制的差异代谢物的火山图见124页彩图6。这些差异代谢物主要为脂质和类脂分子(lipids and lipid-like molecules)、有机酸及其衍生物(organic acids and derivatives)、有机杂环化合物(organoheterocyclic compounds)、苯环型化合物(benzenoids)、有机含氧化合物(organic oxygen compounds)、苯丙素类和聚酮类(phenylpropanoids and polyketides)、有机氧化合物(organooxygen compounds)。分类信息表明脂类与类脂分子在上调和下调差异代谢物数量中占比最多，分别占76.19%和61.96%,见124页彩图7。

图5差异代谢物的聚类热图

图6差异代谢物的火山图

图7差异代谢物分类

2.5 差异代谢物的功能分析

利用KEGG数据库检索197种差异代谢物，结果得到39个信号通路，归属于七大类别(见125页彩图8),包括细胞过程(cellular processes)、药物开发(drug development)、环境信息处理(environmental information processing)、人类疾病(humen diseases)、新陈代谢(metabolism)、生物系统(organismal systems)和遗传信息处理(genetic information processing),主要包括酮体的合成与降解，甘油磷脂代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等信号通路。39个信号通路上显著富集的差异代谢物主要有L-谷氨酰胺、L-色氨酸、L-亮氨酸、三酰甘油等，见表1。

表1富集通路差异代谢物结果

图8差异代谢物的KEGG通路富集分析

3、讨论

3.1 产前瘫痪对脂类代谢的影响

研究发现，三酰甘油、乙酰乙酸、酰基肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰肌醇等代谢物在产前瘫痪羊与健康羊间存在显著差异。脂肪是动物储存能量的主要形式，主要以三酰甘油的形式存在[9]。在母羊妊娠后期三酰甘油含量显著下调，说明母羊在妊娠后期发生了脂肪动员。当机体能量来源不足时，为维持自身需求，便会动员脂肪来获取更多的能量[10]。然而机体消耗大量脂肪后，第一时间会分解成脂肪酸，而乙酰乙酸、酰基肉碱都属于脂肪酸。脂肪动员过度会引起机体的能量负平衡，使其处于应激状态。如果能量负平衡时间过长会使脂肪组织过度分解生成大量非酯化脂肪酸，最终肝脏组织会代谢非酯化脂肪酸生成酮体[11]。酮体是脂肪分解的产物，包括乙酰乙酸、3-羟基丁酸酯和丙酮。乙酰乙酸是中心酮体，在中间代谢过程中产生和利用，并由此衍生出其他酮体；丙酮是由乙酰乙酸自发脱羧产生的，可在临床上鉴别酮症，因而具有临床意义；3-羟基丁酸酯是乙酰乙酸的还原产物[12]。酮体在人禁食期间作为能量基质发挥作用已被广泛认可[13]。这种在饥饿期间作为能量基质的利用不仅限于人类，在其他物种中也很常见。推测母羊因瘫痪而无法正常进食，导致在其饥饿期间酮体为维持能量而大量产生。在本研究中，试验组三酰甘油显著下调，乙酰乙酸显著上调，可能是不能满足妊娠后期多羔母羊的营养需要，导致自身脂肪大量消耗，体内聚集过多游离脂肪酸，引发机体利用酮体来维持自身需求。

酰基肉碱是一种脂肪酸代谢产物，是由脂肪酸与L-肉碱结合形成的酯，在许多细胞能量代谢途径中发挥重要作用。酰基肉碱已被证实的生物学功能是将酰基基团从细胞质转运到线粒体基质中进行β氧化，从而产生能量维持细胞活性[14]。酰基肉碱可分为四类：短链(C2～C5)、中链(C6～C12)、长链(C13～C20)和极长链(>C21)[15],本研究中主要是中链和长链酰基肉碱显著上调。中链酰基肉碱通常是L-肉碱与中链脂肪酸发生酯化反应生成的。在人类禁食试验中发现，血液中短链酰基肉碱的浓度会因为禁食而增加[16]。上述结果与本研究结果一致，进一步说明了酰基肉碱的上调与产前瘫痪母羊发生脂肪动员相关。本研究发现，三酰甘油在试验组中显著下调，磷脂在被磷脂酶水解后脱去1条脂肪酸链所得到的产物就是溶血磷脂，溶血磷脂是溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂乙醇胺和溶血磷脂酰肌醇等一系列化合物的统称[17]。溶血磷脂可以通过减轻肝脏运输的代谢压力和降低三酰甘油水平来促进机体能量平衡，它还作为信号分子参与生命活动[18]。J.Siddharth等[19]研究发现，肌肉减少症的老年小鼠血脂中的溶血磷脂酰胆碱 20∶5和溶血磷脂酰胆碱 20∶3水平降低。以上结果与本研究结果相似。在本研究中，磷脂的显著下调，可能与血液中三酰甘油水平降低和乙酰乙酸水平升高有关。

3.2 产前瘫痪对氨基酸代谢的影响

本研究发现，试验组中亮氨酸和赖氨酸显著上调，色氨酸、苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、脯氨酸显著下调，这些氨基酸都是生酮氨基酸且为必需氨基酸[20]。在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通路(map00280)中发现，亮氨酸和乙酰乙酸含量显著增加。亮氨酸是主要的生酮氨基酸，它可直接作用于3-羟基-3-甲基戊二酸-辅酶a生成酮体[21]。3-羟基-3-甲基戊二酸-辅酶a可直接作用于乙酰乙酸。亮氨酸和乙酰乙酸含量的增加，说明其参与了脂肪动员的启动，大量产生的乙酰乙酸会转化成酮体，进而给机体提供能量。在低血钙奶牛血清中发现赖氨酸含量显著增加[22],在乳热病奶牛的血清代谢物中也发现赖氨酸含量显著增加[23]。色氨酸和苯丙氨酸既是生酮氨基酸也是生糖氨基酸，而L-谷氨酰胺和脯氨酸是生糖氨基酸。妊娠后期葡萄糖的大量消耗也会导致糖异生加剧，为了维持能量的供应，氨基酸可直接进入三羧酸循环为机体提供能量[24]。研究发现，色氨酸参与调节免疫功能和降低动物的应激反应[25-26]。色氨酸下调说明它们被当作底物进入三羧酸循环或者参与糖异生作用产生葡萄糖为产前瘫痪母羊提供能量[24]。Guo C. Z.等[27]在对妊娠毒血症母羊进行造模时，发现造模的妊娠毒血症母羊除组氨酸外的其他生糖氨基酸含量均有所下降。上述结果与本研究结果相似。

4、结论

本研究利用LC-MS技术对产前瘫痪多羔母羊进行非靶向代谢组学分析，共筛选出197种差异代谢物，其中上调差异代谢物有105种，下调差异代谢物有92种。发生产前瘫痪后主要上调代谢物包括乙酰乙酸和酰基肉碱等，主要下调差异代谢物包括溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇等。KEGG富集分析共筛选到39条显著差异代谢通路，主要包括酮体的合成与降解，甘油磷脂代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等。

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基金资助:内蒙古自治区重点研发和成果转化计划项目(2023YFDZ0057);内蒙古自治区自然基金项目(2023MS03048);内蒙古自治区科技计划项目(2021GG0086);国家自然科学基金委员会专项(M2342001);内蒙古自治区揭榜挂帅项目(2022JBGS0024;2022JBGS0012);内蒙古自治区重大专项(2021ZD0024);

文章来源:文兰,乌日古木拉,田进东,等.产前瘫痪多羔母羊血清代谢组学的初步研究[J].黑龙江畜牧兽医,2024,(21):10-15+122-125.