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威灵仙痛风方治疗禽痛风的网络药理学分析及分子对接预测

2024-12-02 120 上传者：管理员

摘要：为预测威灵仙痛风方治疗禽痛风的效果及探究其作用机制，试验采用网络药理学和分子对接的方法对威灵仙痛风方治疗禽痛风的靶点进行预测，并评估其准确性。结果表明：威灵仙复方有效成分158个，相应的作用靶点有66个；禽痛风的作用靶点1 231个，二者互作潜在靶点共33个，其中核心靶点有STAT3、VEGFA、IL6、BCL2L1、IL10、PTGS2、MYC、IFNG和NFKBIA，富集到MAPK、Toll样受体、FoxO和VEGF信号通路等。威灵仙痛风方中的主要活性成分包括槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇等，可能靶向作用于PTGS2、IL6、BCL2L1等靶点，经MAPK、Toll样受体等炎性信号通路发挥治疗效用。

关键词：
分子对接
威灵仙痛风方
禽类痛风
网络药理学
营养代谢病
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禽类痛风是非常普遍的营养代谢病之一，因蛋白质代谢障碍而导致大量尿酸盐在人体关节、内脏器官等处沉积。禽痛风通常发生在鸡和水禽身上，在饲喂高蛋白饲料的雏鹅中尤其常见。禽痛风一般分为内脏型和关节型两种类型，在临床上表现为腿部和翅膀关节肿胀、跛行和腹泻。早期很难发现内脏型痛风，发病时期禽类精神沉郁、食欲下降，排便呈白色石灰样，剖检可观察到内脏上附着白色石灰样物质[1]。肾实质组织和输尿管中也可以见到白色的尿酸盐结晶[2]。关节型痛风主要表现为关节周围肿胀明显，切开有白色米汤状液体渗出。关节周围的软组织由于尿酸盐的沉积而变得发白。在关节周围的组织和腿部的肌肉中有时也会有大量的尿酸盐沉积[3]。

家禽养殖者因经济考量常常采用高蛋白饲料喂养家禽，导致禽类的痛风的高发病率和死亡率，造成巨大的经济损失。由于家禽产生尿酸的途径与人类相似，而威灵仙痛风方对人类痛风性关节炎有较好的疗效，因此威灵仙痛风方对于禽痛风的治疗具有极大的发展潜力。威灵仙痛风方[4]由威灵仙、白术、茯苓、薏苡仁、益母草、甘草以及牛膝组成。威灵仙有祛风除湿、通络止痛、促进尿酸排泄等功效；白术具有燥湿利水的功效；茯苓、薏苡仁常配伍使用，具有健脾、渗湿利水之功效；益母草具有显著利尿作用；牛膝具有抗感染、镇痛、消肿、扩张血管、改善循环等功能；甘草具有减轻药物烈性和调和诸药的作用[5]。徐芳[6]观察威灵仙痛风方对急性痛风性关节炎的治疗效果表明，威灵仙痛风方的疗效优于口服双氯芬酸钠缓释片，能显著降低病人血尿酸、红细胞沉降率以及C反应蛋白含量，说明威灵仙痛风方治疗急性痛风性关节炎效果良好，但中药成分复杂，其作用的实质和机制尚不清楚，研究为兽医临床应用威灵仙痛风方治疗禽痛风提供了理论依据。

1、材料与方法

1.1 药物有效成分及作用靶点的筛选

以威灵仙、白术、茯苓、薏苡仁、益母草、甘草、牛膝为关键词，利用TCMSP数据库筛选有效成分及其相关靶点，筛选条件是口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18。

1.2 疾病相关靶点的筛选

以“poultry gout”“avain gout”“goose gout”为关键词，通过GeneCards、DrugBand数据库检索疾病靶点信息，将所得靶点导入Uniprot数据库中下载物种基因，实现基因标准化处理。

1.3 药物-疾病共同靶点的预测及网络构建

利用在线软件jvenn从所得威灵仙痛风方中筛选出有效活性成分靶点和禽痛风疾病靶点，取药物与疾病共同靶点并绘制韦恩图。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的建立以及核心靶点的筛选

将“禽痛风-威灵仙痛风方”交集基因导入String数据库，Oraganism选项设置为“Gallus”，将最小互作得分设置为0.4，获取PPI网络拓扑分析图，并下载tsv格式文件导入Cytoscape软件进行核心靶点筛选。

1.5 基因本体（GO）功能和京都基因组百科全书(KEGG）途径富集分析

为了进一步阐明威灵仙复方在禽痛风中的作用机理，将以上筛选出的关键靶点导入David数据库，开展GO功能与KEGG通路富集分析，最后实现富集分析结果的可视化。

1.6 分子对接

首先利用PubChem和Uniprot数据库下载PPI度值大于15活性物质的三维结构。然后使用AutoDock 4.2.6计算最小结合能，最后通过AutoDock Tools和Pymol软件进行分子对接，并使对接模型可视化。

2、结果与分析

2.1 威灵仙复方有效成分及作用靶点的筛选

通过TCMSP筛选出威灵仙复方158个有效成分（威灵仙7个、白术7个、茯苓15个、薏苡仁9个、益母草8个、甘草92个、牛膝20个）。将全部药物的有效成分和Uniprot蛋白数据库进行对比，筛选出66个相关靶点，结果见图1。在这些靶点中，槲皮素、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素与β-谷甾醇为中药复方核心作用靶点化合物，连接度（Degree）值均>15，结果见表1。

2.2 威灵仙复方与禽痛风共同靶点的筛选

通过GeneCards数据库找到禽痛风相关疾病的靶点蛋白1 231个，与66个药物有效成分靶点进行交互并绘制韦恩图，得到33个共同靶点，结果见图2。

图1 药物有效成分—靶点对应

表1 威灵仙痛风方核心有效成分（Degree>15)

2.3 中药复方治疗禽痛风靶点蛋白PPI网络的构建

将交集靶点上传到String数据库，获得药物与疾病靶点的PPI网络。图中显示PPI网络包含27个靶点，230条相互作用线，节点度均值为16。最终筛选出9个靶点，分别是信号转导和转录激活因子3(STAT3）、血管内皮生长因子A(VEGFA）、白细胞介素6(IL6）、Bcl-2样蛋白1(BCL2L1）、白细胞介素10(IL10）、PTGS2、核蛋白类癌基因（MYC）、干扰素γ(IFNG）及NF-κ-B抑制剂α(NFKBIA），结果见图3。

图2 威灵仙痛风方与禽痛风的共同靶点

图3 PPI可视化网络

2.4 靶点网络GO功能富集与KEGG通路分析

2.4.1 GO功能富集分析

将图2中的33个靶点上传到David数据库进行GO功能富集分析，得到39个差异显著条目，其中生物过程（Biological Process,BP)34条，细胞组分（Cellular Component,CC)1条，分子功能（Molecular Function,MF)4条。生物过程分析主要包括对白细胞介素-18的反应、树突状细胞凋亡过程、miRNA前体加工的负调节、巨噬细胞活化、对糖皮质激素的反应、白细胞介素-10产生的正向调节、对细胞因子的反应、细胞对镉离子的反应、白细胞介素-8产生的正向调节、胰岛素分泌的调节、白细胞介素-1β生成的正调节、细胞对脂多糖的反应、白细胞介素-6产生的正调节、炎症反应等；细胞组分分析显示靶点主要作用于细胞外间隙；分子功能结果显示，靶点主要与干扰素-γ受体的结合有关，蛋白质具备均二聚体活性，还有细胞因子活性以及与血红素的结合作用。结果见图4。

图4 GO富集分析结果

2.4.2 KEGG通路富集分析

核心靶点上传到David数据库，进行KEGG通路的富集分析，得到18条差异显著条目，结果表明，靶点主要涉及的信号通路有C型凝集素受体信号通路、MAPK信号通路、单纯疱疹病毒1感染、VEGF信号通路、FoxO信号通路、细胞凋亡、NOD样受体信号通路、甲型流感、Toll样受体信号通路、沙门氏菌感染等。结果见图5、图6。

图5 KEGG富集分析结果

2.5 分子对接

选择PPI网络中的槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、异鼠李素（isorhamnetin）和β-谷甾醇（beta-sitosterol）小分子配体与STAT3、VEGFA、IL6、BCL2L1、IL10、PTGS2、MYC、IFNG、NFKBIA蛋白分别进行分子对接，并计算蛋白质与小分子配体的最低结合能（表2），结合能愈小，说明结合构象愈稳定。部分小分子配体与靶点蛋白的对接如图7所示。

图6 靶点—通路拓扑分析网络图

3、讨论

近年来，植物提取物在提高动物生产性能、免疫力和防治多种疾病方面有一定功效[7]。这种天然产品由于其高生物活性和低毒性，在治疗炎症性疾病方面受到了广泛关注[8-9]。Tian等[10]的研究表明，以细胞网络为背景，对中药组成及靶点作用进行研究，有助于了解中药辨证、协调用药的原则。因此，在研究过程中，利用网络药理学多成分、多靶点特性的分析方法，针对威灵仙痛风方剂治疗禽痛风的有效成分、相关靶点、信号通路及二者的生物学机制展开系统且可行性的研究。从中医角度讲，禽痛风属于痹症，朱丹溪《格致余论》描述痛风：“大率因血受热，己自沸腾，其后或涉冷水，或立湿地，或扇取凉，或卧当风，寒凉外抟，热血得寒，污浊凝涩，所以作痛，夜则痛甚，行于阴也。”明确指出，痛风的发病为自身受到热邪侵犯，再受风寒湿邪等引诱，故发为本病。威灵仙痛风方中的威灵仙具有促进尿酸排泄、祛风湿、通经络的功效[11]；白术、茯苓、薏苡仁和益母草益肾利水，温阳补气；牛膝有止痛消肿、改善循环、逐瘀通经、补肝肾、强筋骨，利尿通淋的作用[12]；甘草缓急止痛、调和诸药[4]。从西医角度讲，病机多因饲料蛋白含量过高，导致机体无法正常代谢，进而使得尿酸在内脏和关节中大量积聚。网络药理学研究表明：槲皮素、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素、β-谷甾醇为威灵仙痛风方中主要有效成分。槲皮素和山奈酚大量存在于多种中药材中，具有抗菌、抗炎和抗氧化活性黄酮类化合物[13-14]。槲皮素作为天然类黄酮化合物存在于水果、草药及蔬菜中。经临床试验，槲皮素未有明显的毒性或副作用，且具有抗炎、抗氧化、神经保护、免疫调节等多种生物学特性[15]。豆甾醇和β-谷甾醇是具有抗菌、抗炎和镇痛特性的植物甾醇[16-17]，并且β-谷甾醇可以通过下调TLR4 mRNA相对表达水平，使NF-κB p65磷酸化失活，从而降低各种不良因素刺激的细胞和动物的促炎细胞因子浓度[18]。异鼠李素可抑制NF-κB信号通路，从而抑制炎症反应的发生[19]。威灵仙痛风方不仅能够促进尿酸排泄，还具有抗炎等多种功效。

表2 威灵仙痛风方核心成分与核心靶点的结合情况

图7 较强结合潜力构象的分子对接结果

威灵仙痛风方与禽痛风的共同核心靶点为STAT3、VEGFA、IL6、BCL2L1、IL10、PTGS2、MYC、IF-NG、NFKBIA，富集到MAPK信号通路、VEGF信号通路、NOD样受体信号通路和Toll样受体信号通路。尿酸盐晶体被TLR4识别后诱导TLR4受体激活，并与MyD88适配蛋白相互作用，促进NF-κB信号级联的激活[16]。

分子对接研究结果表明，主要活性化合物对靶点有很好的结合活性，其中PTGS2和IL6临床意义最为显著。PTGS2能够快速编码环氧化酶2(COX-2）的表达，产生的COX-2参与花生四烯酸代谢途径的炎症反应，在痛风引起的炎性反应有重要意义[20]。Gu等[21]研究表明，缓解期痛风患者体内MSU结晶沉积所引发的系统性炎症机制可能与PTGS2表达升高有关。Hao等[22]研究表明，非布司他可以通过抑制PTGS2的活性，减轻局部炎症反应，从而达到缓解痛风的效果。IL-6既直接致炎，又促使其他炎症介质的释放而间接致炎，故在痛风炎症过程中起着更为重要的作用[23]。Chen等[24]研究表明，姜黄素通过抑制NF-κB活化，以剂量依赖性方式抑制IL-6的表达，从而减轻MSU诱导的细胞炎症反应。Li等[25]研究了桑黄对MSU诱导的大鼠产生促炎细胞因子的抗炎作用，研究表明桑黄能缓解关节肿胀，抑制IL-6的表达，而IL-6在急性痛风性关节炎的发病和进展中扮演着关键角色。研究结果表明：槲皮素、山奈酚、异鼠李素和β-谷甾醇结合活性较好，进一步验证了该活性化合物在痛风的治疗过程中可能是通过上述靶点发挥作用。由于物种间存在差异，加之网络数据库及软件算法不完善，这一发现具有局限性，需经过基础或者临床试验的进一步证实，以期得到翔实可靠的研究资料。

4、结论

综上所述，通过网络药理学分析得到威灵仙复方的主要活性成分为槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇等，潜在作用靶点为STAT3、VEGFA、IL6、BCL2L1、IL10、PTGS2。药物成分可能是靶向作用于PTGS2、IL6、BCL2L1等靶点，经MAPK、Toll样受体等信号通路发挥治疗禽痛风的功能。这一中药复方有待进一步的实验验证，为以后临床研究打下坚实的基础。

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