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牛流行性腹泻病毒荧光PCR检测方法的建立

2025-05-24 126 上传者：管理员

摘要：牛流行性腹泻病毒（BVDV）可导致黏膜疾病、呼吸道和肠道感染、生殖功能障碍和持续感染，为全球养牛业造成严重的经济损失。为快速检测BVDV感染，该研究针对BVDV5’-UTR序列设计了引物和Taqman探针，并对引物和探针加入量、退火温度进行了优化，成功建立了BVDV荧光定量PCR检测方法。该方法与牛肠道病毒（BEV）、牛轮状病毒（BRV）、牛细小病毒（BIPV）无交叉反应，特异性良好。该方法在1×10～2～1×10～7copies/μL的范围内线性关系良好，R2=0.9967，最低检出限为1×10～2copies/μL，批内和批间变异系数CV<2%，重复性和稳定性良好。该研究建立的BVDV荧光定量PCR方法可以用于BVDV快速诊断，有助于BVDV的防控。

关键词：
TaqMan探针
检测
流行性腹泻
瘟病毒属
荧光定量PCR
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牛病毒性腹泻病毒是一种属于黄病毒科瘟病毒属的单链正义RNA病毒，BVDV病毒颗粒由基因组RNA和衣壳组成，核衣壳被双层脂质包膜包围，病毒包膜上嵌有Erns，E1和E23种蛋白[1]。BVDV基因组由单个开放阅读框（ORF）和两侧的5’和3’-非翻译区（UTR）组成，其中ORF编码4个结构蛋白（C，Erns、E1andE2）和8个非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[1]。BVDV有3种基因型：BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3，其中BVDV-1目前包含至少22个亚型（1a～1v），BVDV-2包含至少4个亚型（2a～2d）[2]。BVDV主要感染牛，对乳制品行业造成严重的经济损失[3]。BVDV感染可以胃肠道疾病、繁殖障碍、呼吸系统疾病、胎儿畸形和持续感染（PI）[4]。此外，BVDV可感染多种家畜和野生物种，包括绵羊、山羊、鹿、骆驼科动物、猪和野猪，在哺乳仔猪腹泻样本中也可检测到BVDV[5-6]。世界动物卫生组织（OIE）将BVD列为B类传染病，欧洲、美国和英国大部分地区都制定了BVDV控制和根除计划[7]。同时，中国进出口检验检疫将其定为二类传染病[8]。

目前，已建立了各种用于BVDV的诊断方法，包括病毒分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验、免疫组化试验、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、实时PCR、数字液滴PCR（ddPCR）、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR-Cas系统，以及生物传感器等[2]。实时荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点[9]，特别适合用于BVDV的检测。本研究根据BVDV5’-UTR基因的保守序列设计引物和Taqman探针，建立了BVDV荧光PCR检测方法，用于BVDV的诊断、预防和控制。

1、材料与方法

1.1病毒和细胞

牛病毒性腹泻病毒购自中国兽医药品监察所。牛肠道病毒、牛轮状病毒、牛细小病毒均来自市售标准毒株质控品。MDBK细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2试剂和仪器

PremixExTaq（ProbeqPCR），PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）购自Takara，质粒提取试剂盒E.Z.N.A.®PlasmidMiniKitI购自OMEGA，病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3引物及探针

参考BVDVNADL毒株，利用primer3.0引物在线设计网站设计1对特异性引物BVDV-F/R和Taqman探针BVDV-P。引物序列见表1。

1.4标准质粒的构建

参照BVDVNADL毒株RNA序列，根据5’-UTR基因序列合成标准质粒pMV-5UTR。引物、探针和基因合成均由北京六合华大基因科技有限公司完成。合成后转化Trans10感受态扩增质粒，OMEGA质粒提取试剂盒提取标准质粒，测定质粒浓度，根据公式计算拷贝数：拷贝数/μL=[6.02×1023×浓度（ng/μL）×10-9]/（DNA碱基数×660）。

表1引物和探针序列

1.5荧光定量

PCR反应条件的优化以标准质粒为模板，首先对引物及探针使用量进行优化：以探针0.1～0.5μmol/L，引物0.1～1μmol/L，筛选最适引物和探针浓度。之后对荧光定量PCR法的退火温度进行优化，分别采用58、60、62℃退火，筛选最适退火温度。

1.6标准曲线的绘制

以浓度1×101～1×107copies/μL标准质粒为模板，以上述优化过的引物探针比例和退火温度进行荧光定量PCR试验，每组设置3个平行。以拷贝数的log值为横坐标，Ct值为纵坐标，线性拟合标准曲线。通过线性回归分析，计算R2和方程。

1.7敏感性试验

以建立的荧光定量PCR检测方法分别检测浓度1×101～1×107copies/μL的标准模板，确定最低检测浓度，以ddH2O为阴性对照。

1.8特异性试验

以BVDV、BEV、BRV和BIPV的核酸为模板，未接种BVDV的MDBK细胞为阴性对照（MOCK），以优化的反应条件进行试验，对本方法进行特异性评估。

1.9重复性试验

以1×103、1×104、1×105copies/μL标准质粒为模板进行荧光PCR试验，每组3个平行样本，进行组内重复性试验，计算批内变异系数（CV）；上述荧光定量PCR试验共重复3次，即为批间重复性试验，计算批间变异系数，从而评估组间重复性。

1.10样品检测

根据本文建立的BVDV荧光PCR检测方法，对18份牛血清样品进行检测，以标准BVDV毒株作为阳性对照，未接种BVDV的MDBK细胞为阴性对照。

2、结果

2.1荧光定量PCR反应条件优化

根据TAKARAPremixExTaq（ProbeqPCR）说明书建议，采用20μL反应体系进行优化，最终选择的条件如表2。以此条件反应条件进行加样，进行退火温度进行优化，反应条件确定为95℃预变性30s，95℃5s，60℃退火延伸30s，40cycles。

表2优化后的反应体系

2.2标准曲线的测定

根据优化的Taqman荧光PCR方法进行扩增，以拷贝数1×101～1×107copies/μL的标准质粒为模板，以拷贝数的Log值为横坐标，Ct值为纵坐标，线性拟合标准曲线，标曲如图1所示，回归方程为y=-3.6016x+44.485，R2=0.9967。

图1标准曲线的建立

2.3敏感性试验

以浓度1×101～1×107copies/μL标准质粒为模板进行荧光定量PCR检测，ddH2O为阴性对照，按照优化好的条件进行扩增，确定最低检测浓度，结果如图2所示，本方法可检测的最低拷贝数为100copies/μL。

图2BVDV荧光PCR敏感性试验

2.4特异性试验

以本试验建立的荧光定量PCR方法检测BVDV、BEV、BRV和BIPV的核酸，未接种BVDV病毒的MDBK细胞为阴性对照，评估本方法的特异性。结果如图3所示，只有BVDV为阳性扩增，其他样品为阴性，与其他病毒无交叉反应，表明本方法特异性良好。

图3BVDV实时荧光定量PCR特异性试验

2.5重复性试验

按照优化好的方法，以1×103、1×104、1×105copies/μL标准质粒为模板进行PCR试验，每组3个平行样本，计算组内变异系数，如表3所示。在不同时间进行3次荧光定量PCR扩增，计算组间CV值，如表3所示。结果显示，组内和组间CV值均小于2%，说明方法重复性良好。

表3重复性试验

2.6样本检测

结果通过本研究建立的检测方法，对牛血清样本进行检测。结果显示（图4），18份样品均为阳性。

图4BVDV样本检测

3、讨论

BVDV感染能够引起牛的免疫抑制、持续感染、粘膜疾病、呼吸综合征和生殖功能障碍，对全球养牛业造成重大的经济损失[10]。根据是否引起细胞病变，BVDV分为2种生物型：致细胞病变效应（CP）和非致细胞病变效应（NCP）。CP型BVDV少见，多与黏膜病爆发相关，NCPBVDV在自然界中流行，通常与严重的急性感染有关[11]。在2018—2021年间，我国BVDV流行病学调查结果显示，河北、河南和山东等8个省份的血清样品中，河北省的抗体阳性率达90.03%，调查区域牛BVDV抗体阳性率逐年上升，调查区域的组织样品核酸检测显示河北省BVDV阳性率依旧最高，达到20.71%[12]。随着BVD对牛的健康的影响加大，相较于疫苗接种，人们更加倾向于BVD根除计划[13]，因此，准确的BVDV诊断和清除持续感染的牛是控制和根除牛群疾病的基础[2]。已建立多种BVDV诊断方法，例如病毒分离是BVDV诊断的“金标准”，血清学方法的检测，例如ELISA方法具有高特异性、高灵敏度、高通量检测等优点[2]。BVDV分子诊断方面发展迅猛，根据5’-UTR序列设计引物，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法进行BVDV基因型分型[14]；根据5’-UTR序列设计引物和TaqmanMGB探针，能够有效鉴别PI牛[15]；等温扩增技术的发展有利于即时检测POCT，如环介导等温扩增（LAMP）能够检测4.67拷贝的BVDVRNA，具有高灵敏度和高特异性[16]；以5’-UTR序列为检测靶基因，设计crRNA，结合CRISPR-Cas13和侧流层析试纸条进行检测，用于POCT[17]。

本研究根据BVDV5’-UTR序列设计了一组引物和探针，建立了Taqman实时荧光定量PCR检测法，本方法与BEV、BRV和BIPV均没有交叉反应，特异性良好。线性范围1×102～1×107copies/μL，最低检出限为1×102copies/μL，批内和批间变异系数小于2%，重复性和稳定性良好。建立的BVDV荧光定量PCR检测方法可以用于诊断BVDV感染和持续感染动物，以利于及时发现和控制BVDV传染。

参考文献:

[8]王怀禹,刘强,李彩虹,等.南充地区牛病毒性腹泻病的分子流行病学调查及防控措施[J].中国动物保健,2022,24(3):107-108.

[12]和彦良,李真光,苏玮玮,等.2018—2021年中国部分省份牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查[J].中国兽医杂志,2023,59(10):9-15.

基金资助:河北省科学院科技计划项目(23A08,24A08);

文章来源:裴晓萌,于静,杜勇君,等.牛流行性腹泻病毒荧光PCR检测方法的建立[J].现代畜牧科技,2025,(05):8-11.