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伯氏疏螺旋体套式PCR检测方法的建立与应用研究

2020-06-11 416 上传者：管理员

摘要：为了解新疆北疆地区硬蜱携带莱姆病病原伯氏疏螺旋体的流行现状,选择莱姆病病原伯氏疏螺旋体5S-23SrRNA基因间隔区设计嵌套式引物,建立了具有较高敏感性和特异性的伯氏疏螺旋体套式PCR检测方法,应用该方法对2018—2019年在新疆北疆6个地区采集的硬蜱进行伯氏疏螺旋体带菌率检测。结果显示:伯氏疏螺旋体总阳性率为15.17%(81/534),其中青河县阳性率最高,达23.64%(26/110)。提示:应进一步加强及重视北疆地区莱姆病的防控工作。

关键词：
兽医学
北疆地区
套式PCR
检测
莱姆病
蜱
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莱姆病是一种由伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)感染引起,经硬蜱叮咬吸血时进行传播的自然疫源性人畜共患病[1]。可侵害人体多系统及脏器,临床表现多样化。该病分布广、传播快、致残率高,近年来疫源地及发病率均呈现出扩大和上升趋势,已成为严重的世界性公共卫生问题[2,3]。

新疆的气候条件、植被资源为蜱虫的孕育及蜱传疫病的传播提供了良好的生态条件,是我国莱姆病的重要疫区[4]。据报道至少能在35种蜱和少数吸血蚊、蝇、虻、螨、蚤类体内分离到莱姆病螺旋体,但具有保持和传播莱姆病螺旋体能力的只有硬蜱类[5]。本研究选择伯氏疏螺旋体5S-23SrRNA基因间隔区设计特异性引物,建立莱姆病套式PCR检测方法,对2018—2019年采集的硬蜱样本进行检测,以此来了解新疆北疆地区硬蜱携带伯氏疏螺旋体的流行现状,以期为疫病的防控提供数据参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

伯氏疏螺旋体B31标准株(ATCC35210)、大肠杆菌标准株(CVCC1531)、沙门菌标准株(CVCC3762)、钩端螺线体基因组DNA(DSM21537)均由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。

1.1.2试剂

PCRMix,北京庄盟生物技术有限公司;1×PBS稀释液、TE稀释液、DNAMarker,上海生工生物工程技术服务有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,天根生化科技有限公司;BSK培养基,美国Sigma公司;LB培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2方法

1.2.1对照样品DNA的提取

将伯氏疏螺旋体B31标准株、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行培养后,按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明分别提取DNA。

1.2.2套氏PCR检测方法

1.2.2.1引物设计与合成

在伯氏疏螺旋体5S-23SrRNA基因(GenBank登录号JX564636.1)间隔区设计套式PCR引物,并委托昆泰锐生物技术有限责任公司合成,引物序列见表1。

表15S-23SrRNA间隔区套式PCR引物序列

1.2.2.2反应体系

进行2轮PCR反应,每轮体系均为25μL:包括2×TaqMasterMix12.5μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,双蒸水8.5μL,第1轮模板为2μL,第2轮模板为第1轮PCR产物2μL。

1.2.2.3反应条件

第1轮PCR使用引物为23SN1和23SC1,扩增程序如下:94℃预变性10min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;再72℃延伸10min,16℃终止反应。第2轮PCR使用引物为23SN2和5SCB,扩增程序如下:94℃预变性10min;94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸1min,40个循环;再72℃延伸10min,16℃终止反应。

1.2.2.4产物检测

用TAE电泳稀释液配置1%琼脂凝胶,取5μL套式PCR扩增产物分别加入样品孔,以100V恒压电泳,采用凝胶成像系统拍照,阳性可见约为225bp左右的条带。

1.2.2.5敏感性试验

将提取的伯氏疏螺旋体B31标准株DNA应用分光光度计进行含量测定,稀释至1ng/μL后进行10倍系列稀释,浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL,取2μL为模板进行套式PCR扩增,以检测其敏感性。

1.2.2.6特异性试验

以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体B31标准株DNA为模板,进行套式PCR扩增以检测其特异性。

1.2.3检测蜱虫样本DNA提取

在新疆伊犁地区、阿拉山口、呼图壁县、青河县、福海县和五家渠县采集游离蜱和吸血蜱共534只。将蜱浸泡于75%酒精中15min,再用1×PBS稀释液或生理盐水清洗3次,放置于干净的滤纸上吸水干燥。干燥后用镊子将蜱夹放在无菌载玻片上纵切,加适量TE进行研磨,煮沸10min,8000r/min离心5min后取上清,保存于-20℃用于检测。

2、结果

2.1套氏PCR敏感性及特异性

2.1.1敏感性

应用建立的套式PCR检测方法,对稀释后的伯氏疏螺旋体B31标准株DNA进行扩增,电泳后检测,其检测限约为1.0×10-3ng/μL,结果如图1所示。

2.1.2特异性

应用建立的套式PCR检测方法,以伯氏疏螺旋体标准菌株B31和金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、钩端螺旋体的DNA为模板进行扩增,电泳后显示,除伯氏疏螺旋体标准菌株B31扩增出225bp大小的目的条带,其他未见条带,结果如图2所示。

2.2螺旋体的检测

应用建立的套式PCR检测方法,对在新疆北疆6个地区采集的534只硬蜱进行检测,共检出81份阳性,总阳性率为15.17%。其中青河县检测蜱110只,阳性26只,阳性率最高为23.64%;福海县检测蜱18只,全为阴性;其余地区阳性率由高到低依次为呼图壁县22.73%、阿拉山口市18.06%、伊犁地区17.75%、五家渠县2.5%,具体结果见表2、图3。

图1套式PCR敏感性检测

图2套式PCR特异性检测

表2蜱样本巢氏PCR检测结果

图3部分蜱样本套式PCR检测结果

3、讨论

莱姆病诊断的“金标准”是从样本中分离出伯氏疏螺旋体,但其体外分离培养难度大,耗时长、成本高、易污染,且分离率较低。血清学检测方法敏感性和灵敏性又不高,因而分子生物学检测方法越来越多的被应用于莱姆病的检测。套式PCR(Nested-PCR)是一种普通PCR的优化模式,原理是设计2对引物,第2对引物在第1对引物的内部,将第1轮PCR的产物作为第2轮PCR的模板进行扩增[6]。其敏感度和特异性均高于普通PCR,被认为是临床检测螺旋体菌属最敏感的方法之一[7]。本研究选择伯氏疏螺旋体5S-23SrRNA基因间隔区成功设计嵌套式引物,以此为基础建立了套式PCR检测体系,评估了该方法的敏感性和特异性,并成功应用于检测临床样本。

自1987年以来,新疆已先后被证实存在多个莱姆病自然疫源地[8,9,10]。莱姆病通过蜱作为媒介进行传播,要深入地探讨莱姆病的发生与传播的机制,首先需要了解各地蜱伯氏疏螺旋体的带菌情况。本研究对新疆北疆6个地区采集的硬蜱携带伯氏疏螺旋体流行现状进行调查,结果显示6个地区硬蜱伯氏疏螺旋体平均携带率为15.17%。其中青河县最高,达23.64%,福海县未检测到。不同地区间存在差别,与采集的样本数量有关,也可能与采集区域是否是疫源地或莱姆病高发区有关[11]。

牛、羊、犬、兔、鹿和鼠等动物均可感染莱姆病,又通过蜱叮咬后传播给人,该病对人类健康和畜牧业发展已构成极大危害。鉴于此次调查得知新疆北疆地区蜱莱姆病伯氏疏螺旋体携带率较高,应加强莱姆病的防控工作,长期开展蜱虫分布及蜱传疫病检测监测,了解其传播和流行风险,及时预警预报。同时,应做好灭蜱工作,对长期在野外、户外及蜱栖息地、莱姆病疫源地停留的人员,要加强莱姆病防控知识的科普宣传,提高自我防护意识。

参考文献：

[1]杨丽天,高子厚,赵文红,等.云南省德钦县宿主动物感染伯氏疏螺旋体情况初步调查[J].中国热带医学,2015(4):419-421.

[2]毕振旺.莱姆病的流行病学和预防控制[J].山东医药,2012,52(43):89-90.

[3]杨新民,陈芦斌,王晓坤,等.野外军事行动中莱姆病流行病学调查与防治研究[J].解放军预防医学杂志,2018,36(10):1352-1353.

[4]张琳,苗广青,侯学霞,等.套式PCR和实时荧光定量PCR在莱姆病宿主动物监测中的应用评价[J].中国媒介生物学及控制杂志,2018(5):425-427.

[5]梁姝怡,周明浩.蜱媒传染病研究进展[J].中华卫生杀虫药械,2014,20(1):77-81.

[6]叶倩.PCR技术综述[J].科技创新导报,2009(5):5.

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[8]李博,阿扎提·热合木,王信惠,等.新疆乌苏古尔图鼠疫自然疫源地监测分析[J].疾病预防控制通报,2014,29(6):30-31,34.

[9]张琳,侯学霞,耿震,等.套式PCR与LAMP方法在蜱的莱姆病螺旋体检测中的应用[J].中国人兽共患病学报,2014,30(12):1192-1195.

[10]谭毓绘,刘勇,孙荷,等.新疆乌鲁木齐南山莱姆病自然疫源地监测分析[J].中国媒介生物学及控制杂志,2011(2):141-143.

[11]牟路萌.莱姆病､布鲁菌病诊断方法的建立和流行病学调查[D].石河子:石河子大学,2016.