猪繁殖与呼吸综合征,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的以成年猪繁殖障碍、早产、流产、死产和产木乃伊胎,仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡为特征的一种急性、高度传染性疾病。自1987年以来至今,除瑞士、芬兰及澳大利亚等少数地区未见报道外,PRRS已在世界范围内广泛流行,成为严重危害全球养猪业的重要疫病之一。

中国哈兽研郭宝清于1996年从流产猪的胎儿中分离到PRRSV,首次证实了PRRS在中国的存在。2006年初夏,我国出现和流行高致病性PRRSV,发病猪以高热、高发病率和高死亡率以及妊娠母猪严重的繁殖障碍为特征,此次疫情给养猪业造成了巨大经济损失。2012年报道的GM2和QYYZ是弱毒疫苗株与野毒株重组的新型毒株[1]。2014年,国内多个实验室相继报道了一类与美国NADC30毒株高度同源的毒株,该类毒株在Nsp2基因存在131个氨基酸的不连续缺失,并且极易与国内流行的其他亚群毒株发生重组,统称为PRRSVNADC30-like[2,3]。2016年,1-7-4分支PRRSV在美国首次报道,近年已开始在我国流行。2017年,在辽宁省检测出2株1-7-4分支PRRSV,在我国PRRSV基因分群中属于1个新亚群,该类毒株致病性差异较大,引起的临床症状也不尽相同[4]。

本研究旨在了解和掌握安徽地区猪群中PRRSV的感染现状,以及临床感染的流行毒株,从而为安徽地区PRRS的流行病学研究积累有效材料,为安徽地区PRRS的有效防控提供科学依据。

1、材料与方法

1.1样品来源

共收集样品416例,均来自于2017年8月—2018年12月安徽地区16个地市的养猪场(户)。其中病(死)猪组织混样299例、血清71例、精液29例、唾液17例。病(死)猪组织混样采集肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、腹股沟淋巴结以及肠系膜淋巴结。

1.2主要试剂及试剂盒

TIANScriptM-MLV(200U/μL)、TIANScriptTaqDNA聚合酶(5mol/μL)、dNTP、5×First-StrandBuffer、DNAMarker-DL2000、2×TaqPCRMasterMix均购自于天根生物有限公司;PRRSV通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒、PRRSV(NADC30-like)实时荧光RT-PCR检测试剂盒、PRRSV美洲型经典株和高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒、PRRSV美洲株实时荧光RT-PCR检测试剂盒均购自于北京世纪元亨动物防疫技术有限公司;核酸提取试剂盒购自于天隆科技有限公司。

1.3引物设计与合成

根据GenBank中登录的基因序列(登录号:EF635006),利用软件Primer6.0设计PRRSVORF5基因和Nsp2部分基因的特异性引物,见表1。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1PRRSVORF5基因和Nsp2部分基因扩增用引物

1.4样品处理

病料组织样品:将无菌采集的各病料组织(肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、淋巴结等)分别称取约1g,剪碎混匀后取0.05g于研磨管中,加入1mLPBS放置研磨仪中研磨至匀浆,转入1.5mL灭菌离心管中,8000r/min离心2min,取上清液100μL于新的1.5mL灭菌离心管中。

全血样品:待血凝后将全血转入1.5mL灭菌离心管中,8000r/min离心2min,取血清100μL于新的1.5mL灭菌离心管中。

唾液、精液样品:将唾液、精液等充分混匀后,取100μL于1.5mL灭菌离心管中。

阳性对照样品:无菌采集PRRSV鉴定为阳性的各病料组织(肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、淋巴结等),处理方法同1.2.1。

阴性对照样品:无菌采集PRRSV鉴定为阴性的各病料组织(肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、淋巴结等),处理方法同1.2.1。

1.5病毒RNA提取

按照天隆科技有限公司核酸提取试剂盒说明书进行。

1.6PRRSV检测

按照PRRSV通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒说明书进行。

1.7PRRSV毒株类型检测

按照PRRSV美洲型经典株和HP-PRRSV双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒、PRRSV(NADC30-like)实时荧光RT-PCR检测试剂盒、PRRSV美洲型毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒说明书进行。

1.8PRRSV测序鉴定

对未能通过试剂盒检测毒株类型的PRRSV阳性样品,采用RT-PCR对其ORF5基因和Nsp2部分基因进行序列扩增、测序、比对分析鉴定。

1.8.1反转录合成cDNA

反转录体系:dNTP3μL、下游引物1μL、RNA模板10μL、MLV1μL、StandBuffer5μL。反应条件:70℃水浴5min,0℃冰水混合物中冰浴2min,42℃水浴50min。

1.8.2聚合酶链式反应

1.8.2.1PRRSVORF5基因序列扩增

PCR反应体系:cDNA模板2μL、2×TaqPCRMasterMix12.5μL、ddH2O8.5μL、上下游引物各1.0μL。反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸50s,35个循环,72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8.2.2PRRSVNsp2部分基因序列扩增

PCR反应体系:cDNA模板2μL、2×TaqPCRMasterMix12.5μL、ddH2O8.5μL、上下游引物各1.0μL。反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸50s,35个循环,72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8.3序列比对分析

将PCR产物送至安徽通用生物系统有限公司进行测序,所得的序列拼接结果与GenBank上的国内外PRRSV参考毒株进行序列比对及同源性分析,以鉴定毒株类型。

2、结果与分析

2.1样品检测

2.1.1同类型样品的检测

在416例被检样品中,检测出PRRSV的样品有223例,总阳性检出率为53.6%(223/416)。不同类型样品中PRRSV阳性检出率分别为病料组织混样56.8%(170/299)、血清43.7%(31/71)、精液41.3%(12/29)、唾液58.8%(10/17)。其中病料组织混样与唾液之间差异不明显,血清与精液之间差异不明显,病料组织、唾液与血清、精液之间差异均明显。病料组织和唾液更适合用于PRRSV的检测。

2.1.2不同地区样品的检测

416例被检样品源自安徽阜阳、滁州、宿州、黄山、六安、亳州、合肥、淮南、安庆、芜湖、巢湖、池州、淮北、宿松、宣城、蚌埠等16个地市,PRRSV阳性检出率分别为77.0%(47/61)、72.2%(26/36)、66.7%(4/6)、58.3%(7/12)、56.1%(27/48)、52.4%(11/21)、50.9%(57/112)、50.0%(6/12)、47.1%(8/17)、38.5%(5/13)、37.5%(3/8)、33.3%(2/6)、33.3%(4/12)、33.3%(9/27)、30.0%(3/10)、26.7%(4/15)。表明安徽多个地区均存在PRRSV不同程度的感染。

2.1.3不同季度样品的检测

PRRSV阳性检出率在第1季度(1—3月)为72.3%(60/83)、第2季度(4—6月)64.5%(60/93)、第3季度(7—9月)55.6%(45/81)、第4季度(10—12月)36.5%(56/159)。4个季度之间差异性不明显,未呈现流行的季节性。

2.1.4不同阶段样品的检测

PRRSV阳性检出率在保育猪中为69.0%(164/238),育肥猪46.3%(19/41),死胎和弱仔29.2%(40/137)。3个阶段之间差异性均不明显,PRRSV可以感染各年龄段的猪。

2.1.5不同临床症状样品的检测

源自繁殖障碍症状的样品PRRSV阳性检出率为29.2%(40/137),呼吸道症状的样品为65.6%(183/279)。两者之间差异明显。

2.2PRRSV毒株类型检测

2.2.1PRRSV毒株检测

在223例检测出PRRSV的样品中,美洲型经典毒株占比19.7%(44/223),HP-PRRSV占比44.8%(100/223),PRRSVNADC30-like占比13.0%(29/223),美洲型毒株占比22.4%(50/223)。4种类型毒株之间差异明显,显示HP-PRRSV为优势流行毒株。ORF5基因、Nsp2部分基因扩增结果见图1、图2。

图1PRRSVORF5基因PCR鉴定结果

2.2.2不同类型样品PRRSV毒株类型检测

4种类型毒株阳性检出率在病料组织混样中分别为68.2%(30/44)、72.0%(72/100)、58.6%(17/29)、66.0%(33/50),血清样品分别为22.7%(10/44)、20.0%(20/100)、41.4%(12/29)、20.0%(10/50),精液样品分别为0、3.0%(3/100)、0、10.0%(5/50),唾液样品分别为9.0%(4/44)、5.0%(5/100)、0、4.0%(2/50)。不同样品中4种类型毒株之间的占比差异明显。

图2PRRSVNsp2部分基因PCR鉴定结果

2.2.3不同地区PRRSV毒株类型检测

安徽16个地市检测的PRRSV毒株类型不完全一致(表2),其中安庆、亳州、宿州、芜湖以美洲型经典毒株为主,淮南、合肥、滁州、淮北以HP-PRRSV为主,池州、蚌埠、宿松、阜阳以PRRSVNADC30-like为主,黄山、六安、巢湖、宣城以美洲型毒株为主。

表2不同地区PRRSV毒株类型检测结果

2.2.4不同季度PRRSV毒株类型检测

4种类型毒株在不同季度的检出情况见表3,相互之间差异均不明显。

表3不同季度PRRSV毒株类型检测结果

2.2.5不同生长阶段PRRSV毒株类型检测

由表4可见,4种类型毒株阳性检出率在死胎和弱仔、保育猪和育肥猪(除HP-PRRSV和美洲型毒株)阶段相互之间差异均明显。死胎和弱仔及保育猪多见HP-PRRSV,育肥猪多见美洲型经典毒株。

表4不同阶段PRRSV毒株类型检测结果

2.2.6不同临床症状PRRSV毒株类型检测

由表5可见,临诊为繁殖障碍性疾病的样品,4种毒株类型阳性检出率差异明显,以HP-PRRSV多见。临诊为呼吸系统疾病的样品,4种毒株类型阳性检出率差异性均不明显,多种类型毒株并存。

表5不同临床症状PRRSV毒株类型检测结果

3、讨论

PRRS于1987年首先在美国发生,随后几年之内在北美洲和欧洲大陆均有该病发生的报道,现己蔓延至许多亚太地区及国家,目前PRRS已呈世界性分布。根据临床和血清学调查,PRRS在我国广泛存在,而且近年来流行呈上升态势。2008—2011年浙江猪群PRRSV阳性检出率为51.17%[5]。2013—2014年四川部分地区猪群PRRSV阳性检出率为50.7%[6]。2014—2015年河南猪群PRRSV阳性检出率为23.2%[7]。2014—2016年江西猪群PRRSV阳性检出率为52.7%[8]。2014—2016年天津猪群PRRSV阳性检出率为26.26%[9]。2016—2017年我国华北4省市PRRSV检测猪群的阳性率为44.3%[10]。本研究针对2017—2018年安徽临床样品PRRSV感染情况的调查,结果显示猪群中PRRSV阳性检出率为53.6%。不同省份或地区,PRRSV在猪群中的感染程度存在差异,在排除被检样品的数量、类型、来源等影响因素,可以看出安徽同浙江、四川、江西等地的情况相似,均处于PRRSV感染较严重的状态。安徽是养猪大省、全国10个生猪主产省之一,而且安徽处于我国的中部地区,从地理和养殖规模上来看,安徽的情况比较复杂,由于养殖量大以及生猪交易流动性大,因而会导致安徽猪群中PRRSV较高的阳性检出率。PRRSV在安徽流行广泛,不呈现区域性分布,也无季节性流行特点,各阶段的猪均可感染发病,呼吸道症状在临床表现上多见,病料组织和唾液更适合用于PRRSV的检测样品。因此,防控PRRS的最佳策略应是全方位、全面性、全时段的实践,包括从生物安全、疫苗免疫、继发感染控制、监测等措施。

本研究对临床被检样品中PRRSV毒株类型的检测结果显示:检出率最高的毒株为HP-PRRSV(44.8%),目前为安徽的优势流行毒株。2014—2015年河南猪群中HP-PRRSV阳性检出率为37.9%,PRRSVNADC30-like为50%[7]。2014—2016年天津猪群中HP-PRRSV阳性检出率为69.23%,美洲型经典毒株为4.81%,PRRSVNADC30-like为25.96%[9]。2014—2017年山东猪群中HP-PRRSV仍然普遍存在,PRRSVNADC30-like逐渐成为优势流行毒株[11]。2016—2017年我国华北4省市HP-PRRSV阳性检出率为47.1%,PRRSVNADC30-like为52.8%[10]。结合国内其他省市的报道,表明目前临床上PRRSV流行毒株仍以HP-PRRSV为主,但存在其他类型的毒株,并且在PRRSV不同类型毒株中,PRRSVNADC30-like流行趋势逐渐增强,我国多个地区开始以PRRSVNADC30-like为临床优势流行毒株,目前尚没有针对该毒株的疫苗,这也是导致PRRSVNADC30-like的流行逐渐呈现上升趋势的主要原因。

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基金:安徽省重点研究与开发计划(面上攻关)项目(201904a06020013);安徽省生猪产业体系基金项目(皖农科[2016]84号);安徽省质量工程项目(2013sxzx008)