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探析分离鉴定及spaA基因序列猪丹毒杆菌情况

2020-06-18 439 上传者：管理员

摘要：从猪丹毒疑似病例肺脏中分离到1株革兰阳性小杆菌,编号为YN19071,对其进行形态学、分子生物学鉴定,并研究其致病性、耐药性以及spaA基因遗传进化关系。16SrRNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,结果显示分离株YN19071与猪丹毒杆菌模式菌株ATCC19414T同源性99.9%,对小鼠有较强的致病性。spaA基因进化分析显示,YN19071与10株猪丹毒杆菌中国分离株之间的同源性为98.8%～99.5%,与疫苗株G4T10同源性为99.3%。与疫苗株G4T10相比较,云南分离株YN19071的spaA基因存在3个突变位点T609G、A635G和A671G,对应的氨基酸序列也存在3个突变位点I203M、E212G和E224G。本研究在首次对云南猪丹毒杆菌spaA基因遗传进化分析,对云南猪丹毒杆菌的疫苗免疫防控具有指导意义。

关键词：
spaA基因
丹毒丝菌科丹毒丝菌属
分离
哺乳动物
水产动物
猪丹毒杆菌
禽类
致病性
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红斑丹毒丝菌又称猪丹毒杆菌,为丹毒丝菌科丹毒丝菌属的成员。该菌可感染多种哺乳动物、禽类和水产动物。其中猪感染最为常见,牛、羊、鸡、鸭、鸽子、鱼等多种动物也易感[1,2,3],人可经外伤局部感染而发生“类丹毒”[2]。近年来,猪丹毒在中国多个省份零星暴发或流行性发生,其发病率呈上升趋势,且常常导致急性死亡,给养猪业造成严重的经济损失,严重威胁畜牧业的健康发展。

2019年9月,昆明某猪场发生肥猪急性死亡病例,发病率为6%,病死率为67%。病猪主要临床表现为体温升高至41℃,结膜充血,耳朵、腹部和四肢内侧皮肤出现红斑;部分病死肥猪前1天无临床症状;病死猪剖检可见肺脏充血出血、脾脏肿大呈樱桃红色、淋巴结肿大出血。采集脾脏、肺脏和淋巴结组织病料,送云南省畜牧兽医科学院/云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室进行诊断,均分离到1株革兰阳性多形小杆菌YN19071,且对小鼠具有较强致病性。笔者对分离株YN19071进行鉴定并对其表面保护性抗原A基因进行遗传进化分析,为疫苗株的选择提供科学指导。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂:

营养琼脂购自北京奥博星生物技术有限公司,细菌革兰染色试剂盒购自杭州滨和微生物试剂有限公司,细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,2×EasyTaq®PCRSuperMix和Trans2KDNAMarker购自北京全式金生物技术有限公司,药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.1.2实验动物:

20g昆明小鼠购自昆明医科大学。

1.2方法

1.2.1细菌分离:

将病死猪肺脏、肝脏和淋巴结分别划线接种于营养琼脂平板,37℃培养过夜,挑取单菌落进行纯培养。挑取菌落制作涂片,革兰染色镜检,观察菌体形态。

1.2.2引物设计:

细菌16SrRNA上游引物27F(A):5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和下游引物1492R(T)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′按参考文献[4]设计;细菌spaA基因上游引物Erko-1F(5′-GTGAAACACCGTATTTTAGTA-3′)和下游引物Erko-2R(5′-TTCAAGAAGTTCCTGTAGTTT-3′)按参考文献[5]设计;2对引物均由北京擎科新业生物技术有限公司昆明分公司合成。

1.2.316SrRNA和spaA基因测序:

用细菌基因组提取试剂盒提取YN19071的基因组DNA作为模板,采用引物27F和1492RPCR扩增16SrRNA基因;采用引物Erko-1F和Erko-2R扩增spaA基因,2个PCR反应条件均为94℃预变性3min;94℃30s、57℃30s,72℃30s,35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,鉴定正确后送北京擎科新业生物技术有限公司昆明分公司测序。

1.2.416SrRNA鉴定:

将测序所得16SrRNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对鉴定。

1.2.5spaA基因进化分析:

从GenBank数据中下载猪丹毒杆菌spaA基因序列,用EditSeq软件将spaA基因翻译为氨基酸序列,用MegAlign软件进行核苷酸序列比对和氨基酸序列比对,分析分离株YN19071的spaA基因同源性和氨基酸序列同源性。同时用Clustal_X1.83软件进行spaA基因多序列比对分析,用MEGA4.0.2软件构建NJ系统进化树(Neighbor-Joining),bootstrapvalues值设定为1000,分析分离株spaA基因进化关系。

1.2.6致病性试验:

将分离株YN19071接种营养肉汤培养基,37℃培养24h,用平板计数法测定菌液的浓度,再用灭菌生理盐水调整菌液浓度为1×103CFU/mL。实验组3只小鼠腹腔注射菌液,0.2mL/只;对照组3只小鼠腹腔注射生理盐水,0.2mL/只。分析分离株对小鼠的致病性。

1.2.7药敏试验:

用CLSI2015推荐的Kirby-Bauer方法,测定分离株YN19071对10种抗菌药物的敏感性。

2、结果

2.1细菌分离结果

分离到1株细菌,编号为YN19071。分离株YN19071在营养琼脂平板上形成半透明小菌落,菌落凸起、湿润、光滑、边缘整齐。革兰染色呈革兰阳性多形小杆菌(图1)。

图1分离株YN19071革兰染色形态(1000X)

2.216SrRNA鉴定结果

分离株YN1907116SrRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳得到1条约为1500bp的条带,与预期大小相符,将16SrRNA基因序列提交GenBank数据库,基因收录号MT163391。BLAST比对结果显示,分离株YN19071与各猪丹毒杆菌参考株之间的同源性为96.7%～100%,其中与西班牙分离株CTL-27的同源性为96.7%,与湖南分离株NX12.7的同源性为100%,与猪丹毒杆菌模式菌株ATCC19414T的同源性为99.9%,因此将分离株YN19071鉴定为猪丹毒杆菌。

2.3spaA基因进化分析结果

分离株YN19071spaA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳得到1条约为500bp的条带,与预期大小相符,将spaA基因序列提交GenBank数据库,基因收录号MT178262。spaA基因系统进化树显示,YN19071与1株湖南株、2株广东株、7株江苏分离株以及疫苗株G4T10形成一个大的进化分支(图2),YN19071与10株中国分离株(CS12.4、GD1201、SH130723、XC130710、YC131115、HX130709、GD-GZ、YC130820、NZ130701和YC130828)之间的同源性为98.8%～99.5%(图3),与疫苗株G4T10的同源性为99.3%,其进化关系较近。与疫苗株G4T10相比较,云南分离株YN19071的spaA基因存在3个突变位点:T609G、A635G和A671G。3株日本分离株形成另一个大的进化分支(图2),其与YN19071之间的同源性为97.9%～98.8%(图3)。用MegAlign进行SpaA氨基酸系列比对分析显示,与疫苗株G4T10相比较,云南分离株YN19071的SpaA蛋白氨基酸序列存在3个突变位点I203M、E212G和E224G。

图2基于spaA基因构建的系统进化树

图3spaA基因核苷酸同源性比对结果

2.4致病性试验

实验组3只小鼠均在接种后5h出现被毛逆立、呼吸急促的临床症状,在接种后24h内全部死亡;对照组3只小鼠健康存活。表明分离株YN19071对小鼠有较强的致病性。

2.5药敏试验

分离株YN19071对青霉素、氨苄西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢噻肟、卡那霉素片和氟苯尼考敏感,对庆大霉素、氧氟沙星和磺胺甲噁唑耐药。

3、讨论

在20世纪80、90年代,猪丹毒与猪瘟、猪肺疫并称为中国养猪业的三大传染病,给我国养猪业造成严重的经济损失,但随着疫苗免疫防控的普及,猪丹毒得到了很好控制。近年来,很多猪场都已不再使用猪丹毒疫苗,猪丹毒在我国的云南、江苏、江西、安徽、福建等多个省份零星暴发或流行性发生,其发病率呈逐年上升趋势,给养猪业造成了严重的经济损失。因此,开展猪丹毒杆菌的分离鉴定、药物敏感性试验、致病性试验以及主要保护性抗原spaA的遗传进化分析等研究工作对猪丹毒的治疗和疫苗免疫防控具有重要指导意义。

药敏试验结果表明:分离株YN19071对庆大霉素、氧氟沙星和磺胺甲噁唑耐药,表现为多重耐药性;对青霉素、氨苄西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢噻肟、卡那霉素片和氟苯尼考敏感,与大部分安徽分离株相似(分离株对卡那霉素片敏感除外)[6]。YN19071对青霉素和头孢类抗菌药物敏感特性,与河南分离株相似[7],表明青霉素和头孢类抗菌药物仍然可作为近年来猪丹毒治疗的首选药物。

SpaA是猪丹毒杆菌主要保护性抗原蛋白,对多种血清型的猪丹毒杆菌具有良好的免疫保护效果,可作为研制猪丹毒杆菌亚单位疫苗的候选抗原[8,9]。本研究从云南某猪场猪丹毒疑似病例中分离到猪丹毒杆菌YN19071,其对小鼠有很强的致病性,腹腔接种2×102CFU可使小鼠在24h内100%死亡。spaA基因遗传进化分析显示,云南分离株YN19071与10株中国分离株以及疫苗株G4T10在进化树中形成同一进化分支(之间的同源性为98.8%～99.5%),遗传进化关系较近,提示疫苗G4T10可能对中国分离株具有较好的保护作用。与疫苗株G4T10相比较,云南分离株YN19071的spaA基因存在3个突变位点:第609位核苷酸由胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤(T609G),第635位核苷酸由腺嘌呤突变为鸟嘌呤(A635G),第671位核苷酸由腺嘌呤突变为鸟嘌呤(A671G)。YN19071spaA基因突变位点数量少于彭凌等报道的突变位点数量[10]。与疫苗株G4T10相比较,云南分离株YN19071的SpaA蛋白氨基酸序列也存在3个突变位点:第203位氨基酸由异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I203M),第212位氨基酸由谷氨酸突变为甘氨酸(E212G),第224为氨基酸由谷氨酸突变为甘氨酸(E224G)。YN19071SpaA蛋白氨基酸突变位点多于车勇良等报道的突变位点数量[11]。另外,云南分离株YN19071的致病性强于车勇良等[11]报道的分离株,由此推断,SpaA蛋白氨基酸突变位点与致病性可能正相关。国内疫苗株G4T10对云南分离株的保护效果有待进一步研究。

参考文献：

[6]陆萍,黄晓慧,李春芬,等.安徽部分地区猪丹毒杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].微生物学通报,2014,41(9):1822-1828.

[7]徐引弟,王治方,张青娴,等.猪丹毒丝菌河南株的分离鉴定[J].上海畜牧兽医通讯,2020(1):15-18.

[9]吾鲁木汗,那孜尔别克,张磊,等.猪丹毒丝菌天然SpaA和重组SpaA-N免疫保护效果的评价[J].微生物学报,2010,50(3):367-372.

[10]彭凌,杨旭夫.猪丹毒丝菌的分离鉴定及其spaA基因高变区域的序列分析[J].中国兽医学报,2016,36(10):1727-1732.

[11]车勇良,陈如敬,王隆柏,等.猪丹毒杆菌的分离鉴定及其spaA基因的遗传变异分析[J].中国兽医学报,2011,31(11):1591-1604.

李文春,杨仕标,李富祥.一株猪丹毒杆菌的分离鉴定及spaA基因序列分析[J].上海畜牧兽医通讯,2020(03):9-12.

基金:云南省创新人才计划项目(2017HB090).