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不同核酸提取试剂盒对PRRSV核酸的提取效率研究

2020-12-04 525 上传者：管理员

摘要：为比较不同核酸提取试剂盒对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸的提取效率，使用国家标准物质“猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质”作为模拟样品，分别使用试剂盒A、B、C（磁珠法）以及试剂盒D、E（柱式法）等5种核酸提取试剂盒进行核酸提取，然后通过荧光RT-PCR和数字RT-PCR方法评估提取效率，并分析不同基质对提取效率的影响。结果显示：5种试剂盒均能有效提取PRRSVRNA，其中磁珠法的提取效率高于柱式法；试剂盒B和C对PRRSVRNA的提取效率较高；基质会对提取效率造成影响，精液和抗凝血对试剂盒提取效率的影响较大。综上，试剂盒B、C均可适用于猪繁殖与呼吸综合征临床样品的核酸提取。实际操作中，应根据实验室条件、样品数量、样品类型和时间要求等因素，选择应用合适的提取试剂盒。

关键词：
养猪业
数字PCR
标准物质
核酸提取
猪繁殖与呼吸综合征
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自1995年我国暴发猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）疫情以来，该病始终伴随我国养猪业的发展。尤其是2006年暴发的高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）疫情，给我国养猪业造成了巨大的经济损失，此后PRRS成为影响我国养猪业发展的主要疫病之一[1,2]。2006—2014年，我国猪群中流行的PRRSV主要为高致病性PRRSV(HP-PRRSV）以及针对该毒株的疫苗株，但2014年以后我国许多省份发现的类NADC30PRRSV又导致了PRRS疫情的波动发生[3]。

对于PRRSV等主要动物疫病病毒的分子生物学检测，除了检测试剂盒的特异性、敏感性和重复性等因素对检测结果影响较大外，病毒RNA提取也是关键环节之一，RNA的提取效率和质量直接影响最终检测结果的准确性。随着高分子材料的快速发展，RNA提取技术已由传统的液相系统分离技术转变为固相载体吸附技术，如膜吸附技术、磁珠吸附技术等，其中膜吸附技术（离心柱提取法）已被普遍应用。该方法提取率较高且质量稳定，但至今未实现高通量自动化操作。磁珠吸附技术（纳米磁珠法）提取效率高，且可通过仪器自动化批量提取，操作简单，目前已被众多实验室采用[4]。

以往试剂比对工作中，往往以质粒、病毒分离株、已知浓度临床样品等作为标准品，但在稳定性和均匀性上均有所局限，难以保证比对试验科学准确。本研究使用国家标准物质“猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质”作为提取样本。该标准物质具有稳定、均匀和准确等特征，是定性和定量测量分析的一种标杆[5]，可应用于检测活动的校准、评估和质量控制，从而为评估核酸提取试剂盒的提取效率提供了支撑。

为优选出提取效率高的核酸提取试剂盒，本研究选择5种试剂盒分别提取不同浓度的PRRSV核酸标准物质，使用荧光RT-PCR和数字RT-PCR方法进行检测，通过Ct值和核酸含量评价病毒RNA提取效率。

1、材料与方法

1.1标准物质

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质：编号GBW(E)090930，由中国动物疫病预防控制中心研制，量值为（2.06±0.15）×104copies/μL，于-20℃保存备用。

1.2试剂与仪器

1.2.1核酸提取试剂盒

5种RNA病毒提取试剂盒，其中试剂盒A（进口）、B（国产）、C（国产）为磁珠法机提，试剂盒D（进口）、E（国产）为柱式手提，分别购自各品牌供应商。

1.2.2主要试剂

PRRSV通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；One-stepRT-ddPCRKitforProbes，购自伯乐公司。

1.2.3主要实验仪器

Qiagentissuelyserii组织研磨仪，购自QIAGEN公司；ThermoKingFisherDUO磁珠提取仪，购自赛默飞公司；ABI7500fast荧光PCR仪，购自Life公司；QX200微滴式数字PCR仪，购自伯乐公司。

1.3比较方法

1.3.1RNA提取

对试剂盒D和E，采用离心柱吸附技术，按照试剂盒说明书，手动提取病毒RNA；对其余3种试剂盒，均采用磁珠法，按照试剂盒说明书，运用相应核酸提取仪，自动提取病毒RNA。分别使用上述5种试剂盒对2种浓度的PRRSV核酸标准物质做3次平行提取，共获得30份提取产物。

1.3.2荧光定量RT-PCR方法

采用PRRSV荧光RT-PCR检测方法，按照试剂盒说明书对30份提取产物分别进行反转录扩增。通过Ct值比较不同试剂盒的RNA提取效率。

1.3.3数字RT-PCR方法

采用微滴式PRRSV通用型数字RT-PCR检测方法，对30份提取产物分别进行反转录扩增。上游引物序列为CGCTTCCRGATGCMGWTTGTG，下游引物序列为CGCCACTCCYYGTTTAACAGC，探针引物序列为TACMTTCTGGCVCCTGCCCA，引物探针由英潍捷基有限公司合成。数字RT-PCR反应体系为：2×One-stepRT-ddPCRSupermixforprobes10μL，上、下游引物溶液各1μL，探针溶液0.2μL，模板2μL,RNaseFreedH2O5.8μL。数字RT-PCR扩增程序为：42℃反转录60min;95℃预变性10min;95℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；最后98℃延伸10min。升降温速度设置为2.5℃/s。通过核酸含量（copies/μL）比较不同试剂盒的RNA提取效率。

1.3.4不同基质对核酸提取效率的影响

选用TE、抗凝血、血清、血浆、扁桃体、淋巴结、肺脏、精液、唾液、饲料等多种常见基质，探究不同基质对核酸提取效率的影响，其中对组织采取匀浆处理，TE、血清等直接使用。在上述基质中，5倍稀释PRRSV标准物质后，分别提取3次，通过荧光RT-PCR和数字RT-PCR方法进行扩增，比较试剂盒对不同基质中病毒RNA的提取效率。

2、结果与分析

2.1荧光RT-PCR方法比较提取效果

3种磁珠法机提试剂盒的Ct平均值明显低于柱式手提试剂盒，提取较高浓度核酸标准物质时（2×104copies/μL），扩增后Ct值从低到高排序为B<A<C<D<E，其中试剂盒A、C提取的样本扩增后Ct值相近；提取较低浓度核酸标准物质时（4×103copies/μL),Ct值从低到高排序为C<B<A<D<E，其中试剂盒B和C提取的样本扩增后Ct值相近。详见表1。

表15种试剂盒提取效率比较（荧光RT-PCR方法）

2.2微滴式数字RT-PCR方法比较提取效果

试剂盒B、C提取的样本扩增后产物浓度相对较高，核酸提取试剂盒回收率可达98.50%以上。提取较高浓度核酸标准物质（2×104copies/μL）和较低浓度核酸标准物质（4×103copies/μL）时，核酸提取试剂盒回收率从高到低排序均为C>B>A>D>E。详见表2。

2.3操作性比较

试剂盒D、E为手动提取，操作相对复杂，耗时长。A、B、C等3种试剂盒均可通过仪器自动化或半自动化提取，操作相对简便，提取RNA耗时较短。但试剂盒C必须使用配套仪器提取，使用存在一定限制。

表25种试剂盒提取效率比较（数字RT-PCR方法）

注：核酸提取试剂盒回收率是与标准物质量值相比较而获得。

2.4不同基质对核酸提取效率的影响

综合2.1～2.3结果分析，本研究选择试剂盒B、C，分析不同基质对试剂盒提取效率的影响。结果显示，对于试剂盒B，抗凝血对提取效率影响最大，精液次之，淋巴结、TE、扁桃体等基质影响较小；对于试剂盒C，精液对提取效率影响较大，其他基质影响较小；两种试剂盒相比较，提取抗凝血、血清、饲料、唾液、扁桃体、肺脏、TE、血浆中的PRRSVRNA时，试剂盒C的提取效率均高于试剂盒B，提取淋巴结中的PRRSVRNA时，试剂盒B的提取效率略高于试剂盒C，提取精液中的PRRSVRNA时，试剂盒B的提取效率高于试剂盒C。详见表3。

表3不同基质添加对提取效率的影响

3、讨论

本研究选取了2种柱式核酸提取试剂盒、3种磁珠核酸提取试剂盒进行分析，发现5种核酸提取试剂盒均能有效提取PRRSVRNA，其中磁珠提取试剂盒的提取效率要显著高于柱式提取。提取较低浓度核酸标准物质时，3种磁珠提取试剂盒回收率平均值为96.12%，柱式提取试剂盒回收率平均值仅为41.95%。其原因除了柱式提取本身结合能力有限之外，还可能是因为PRRSV作为RNA病毒，RNA分子不稳定，易分解，加之RNase无处不在，而柱式核酸提取试剂盒在实际操作中需要反复开盖、加液和离心，操作更复杂，造成RNA分解的概率更高。两种方法相比较，磁珠提取可实现高通量、自动化，更适用于高通量检测，但试剂和提取仪器成本较高；而柱式核酸提取试剂盒成本低、方法可靠，适合少量样品的核酸提取。因此对于两者的选取，需要根据实验室条件、样品数量和任务紧迫性等多种因素综合考虑。

在PRRS诊断方法中，核酸扩增技术更为简便、快捷和准确，于感染后24h即可检测到病毒，对于PRRS的早期诊断意义重大。但通过核酸扩增检测PRRSV试验过程比较复杂，涉及病料样品的RNA提取、反转录、PCR扩增等多步操作。此外，样品中核酸的不均匀性和样本基质的多样性，给标准化带来了一定的困难。PRRSV核酸标准物质的成功研制，可以实现对核酸提取、反转录、PCR扩增3个环节的质量控制，在实验室检测过程中具有很好的适用性，对实验室的人员操作、仪器校准等内部质量体系控制和推动PRRSV核酸检测标准化都起着不可或缺的作用。

数字PCR方法可实现绝对定量，更适用于检测方法和试剂比对。在本研究中，通过荧光PCR方法扩增，试剂盒A、B、C的提取效率均较高，无明显差异；而通过数字PCR方法，试剂盒B和C的提取效率分别比试剂盒A高1.7倍和1.8倍，更精确体现了试剂盒提取效率的差异。荧光RT-PCR在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性，只能实现定性和半定量检测，无法对病毒核酸进行精确定量。而微滴式数字化PCR通过微滴发生器将每个样品分成20000个均匀的纳升级微滴，每个微滴都作为一个独立的PCR反应器进行检测，可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数，准确度和灵敏度更佳，可更精确地比较提取试剂盒的效率差异。

通过基质稀释标准物质，能够在一定程度上反映不同基质对PRRSV核酸提取的影响，但不能完全模拟感染动物组织中的PRRSV核酸提取情况，仅可为实验室人员提取不同基质中PRRSV核酸时选择试剂盒提供参考。

5种试剂盒均能有效提取PRRSVRNA，其中磁珠法的提取效率高于柱式法；试剂盒B和C对PRRSVRNA的提取效率较高；基质会对提取效率造成影响，精液和抗凝血对试剂盒提取效率的影响较大。综上，试剂盒B、C均可适用于PRRSV临床样品的核酸提取。实际操作中，应根据实验室条件、样品类型、样品数量和时间要求等因素，选取应用合适的提取试剂盒。

参考文献：

[4]赵升,姬艳芳,张璐,等.一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价[J].中国病毒病杂志,2019(2):135-138.

[5]原霖,李尔华,董浩,等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒国家核酸标准物质的研制[J].中国兽医学报,2019(5):826-829.

徐琦,韩焘,原霖,张硕,李晓霞,刘颖昳,毕一鸣,顾小雪.应用猪繁殖与呼吸综合征核酸标准物质比较5种核酸提取试剂盒[J].中国动物检疫,2020,37(12):120-123.

基金:国家重点研发计划项目(2018YFD0500800).