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鹅源沙门氏菌的致病性与耐药性研究

2020-12-15 243 上传者：管理员

摘要：为确定引起辽宁省营口市某养鹅场鹅腹泻原因，试验采集50份病料（肝脏和脾脏），进行细菌分离培养、生化分析、PCR鉴定、病原菌16SrRNA序列比对、药敏试验、致病性试验和病理组织的观察。结果表明：从病料中成功分离3株沙门氏菌；致病性试验结果显示，小鼠死亡率90%，表现脑膜充血、肝脏淤血、脾脏肿大等病理变化；雏鹅发病率100%、死亡率86.7%，表现为肝脏肿大、淤血、灰白色坏死点，心包膜增厚并伴有纤维素性心包炎等病理变化；耐药性结果显示，分离菌株对四环素、氟苯尼考的耐药率高达100%，对磺胺异恶唑、氧氟沙星的耐药率大于66.7%，对恩诺沙星的耐药率33.3%，而对庆大霉素、头孢噻呋、黏杆菌素、氨苄西林、大观霉素、安普霉素高度敏感。结果提示，该养殖场鹅腹泻病主要致病菌为沙门氏菌，该菌具有较强的致病性和耐药性。

关键词：
分离鉴定
沙门氏菌
耐药性
致病性
鹅
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鹅沙门氏菌可引起鹅的肝脏、脾脏、脑等多种器官组织发生病变[1,2,3]。鹅沙门氏菌属于条件致病菌，主要危害雏鹅，成年鹅多呈慢性或隐性经过。患病鹅和病愈的带菌鹅是主要的传染源，该菌可通过多种途径水平传播，也可通过种蛋垂直传播[4,5]。近年来，鹅沙门氏菌病常与其他病原混合感染[6]，且鹅沙门氏菌的致病性、耐药性等不断增强。本研究通过对辽宁省营口市某鹅场发病鹅的病料进行菌种的分离鉴定、16SrRNA序列比对、药敏试验、致病性试验和病理组织的观察研究，为鹅源沙门氏菌病的诊断和防治提供参考。

1、材料与方法

1.1病料采集

2019年11月10日，营口市某养鹅场15日龄左右雏鹅发病，该场饲养东北小白鹅8000只，其中雏鹅3200只，发病率40%，死亡率32.5%。患病鹅主要表现为精神沉郁、排白色或绿色稀粪、可视黏膜苍白、肝脏淤血肿大、表面有灰白色坏死点；以纤维素性心包炎为主，皮下出血、心肌出血、心包膜增厚并附有纤维素性绒毛或伪膜、肺脏充血出血、脾脏淤血肿大、肠系膜出血、盲肠积粪、脑膜充血。采集病料50份，24h内送回实验室待检。

1.2试验试剂

三糖铁琼脂培养基（TSI）、琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限公司；细菌微量生化反应鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.3试验动物

体重18～22gSPF级昆明小鼠50只购自锦州医科大学实验动物中心；3日龄健康雏鹅50只购自沈阳鑫洋养鹅场。

1.4试验方法

1.4.1分离纯化与形态学观察

病料接种于BPW培养基，37℃培养18h接种于HE培养基中，37℃培养18h选取中心为黑色、中等大小的典型菌落，进行革兰氏染色镜检。镜下观察为红色、两端钝圆的短小杆菌，挑取剩余的典型菌落接种于NB培养基中，37℃、150r/min振荡过夜，检验为纯培养物，-80℃保存、备用。

1.4.2生化鉴定

将NA培养基上的单菌落划线接种于TSI斜面培养基，37℃培养24h。取疑似菌落接种于细菌微量生化反应管内，37℃培养24h观察并记录结果。

1.4.3分子生物学试验

GenBank上公布的16SrRNA通用引物（27F:AGAGTTTGATCATGGCTCAG;1492R:TACGGTTACCTTGTTACGACTT）由上海生工生物公司合成，目的片段1450bp。将提取的DNA为模板与合成的引物进行PCR扩增。PCR反应体系50μL:2×TaqMasterMix缓冲液25μL、DNA模板5μL、上游引物和下游引物各2μL、ddH2O16μL。反应条件：95℃预变性5min、94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸45s，共进行30个循环，最后72℃再延伸10min,4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，符合目的片段大小的条带送上海生工生物公司测序，使用NCBI数据库的Blast在线比对软件测序分析。

1.4.4动物致病性试验

选取鉴定纯化的3株沙门氏菌复苏培养，编号为G、P、S。吸取40μL菌液加入NB培养基中，37℃、150r/min振荡过夜，吸取1000μL菌液至无菌EP管中，10000r/min离心10min，将沉淀菌体用无菌PBS溶液重悬，反复3次后用适量无菌PBS溶液重悬稀释，制成悬菌液备用。将小鼠随机分为5组，每组10只，分为感染G组、感染P组、感染S组、健康对照组和空白对照组。雏鹅分组、数量及处理方法与小鼠一致，见表1。接种后相同环境下隔离饲养，观察7d，记录临床症状、死亡时间和数量；对死亡小鼠剖检，观察器官病理变化；采集肝脏、脾脏、盲肠、脑等发病器官组织接种于HE培养基，分离纯化，革兰氏染色观察细菌生长形态。

表1小鼠致病性试验分组与处理

1.4.5药敏试验

采用细菌药敏测定试剂盒进行抗菌药物最小抑菌浓度（MIC）测定。根据美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准进行结果判定，具体方法按说明书进行。

2、结果与分析

2.1细菌分离培养结果（见图1、图2)

图1HE培养基上沙门氏菌的生长形态

图2显微镜下沙门氏菌的形态

由图1和图2可知，分离的3株细菌在HE培养基上形成中等大小、中心为黑色的圆形菌落；阴性、两端钝圆的短小杆菌，符合沙门氏菌的形态特征。

2.2生化试验结果（见表2)

3株细菌均使TSI斜面培养基变红，底部产硫化氢变黑。由表2可知，发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，M-R、枸橼酸盐、硫化氢试验为阳性，乳糖、蔗糖、V-P试验为阴性，符合沙门氏菌生化试验特性。

2.3PCR鉴定结果（见图3)

由图3可知，通过PCR扩增与凝胶电泳试验得到的条带大小为1450bp，与目的条带符合。序列进行Blast对比，与沙门氏菌同源性高于99%。

表2生化试验结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

图316SrRNAPCR鉴定结果

2.4动物致病性试验结果

2.4.1小鼠致病性试验结果（见表3、图4、图5)

表3小鼠致病性试验结果

图4小鼠典型临床症状

图5小鼠器官典型剖检变化

由表3可知，小鼠的死亡率90%,G组、P组沙门氏菌阳性率100%,S组阳性率90%。由图4可知，发病小鼠临床症状表现为精神萎顿、聚堆、羽毛松乱、流泪、眼角有黄色分泌物等。由图5可知，剖检可见肝、肺、肾、脾、脑及肠道等器官发生出血症状。健康对照组和空白对照组小鼠均未发病和死亡。

2.4.2雏鹅致病性试验结果（见表4和图6)

由表6可知，雏鹅的发病率100%，死亡率80%以上；G组、P组和S组沙门氏菌阳性率均100%。由图6可知，发病雏鹅临床症状表现为精神萎顿、排白色或绿色稀粪、抽搐等神经症状，剖检可见皮下、肝、肺、脾、心及肠道等器官发生出血等症状。

表4雏鹅致病性试验结果

图6雏鹅典型病理变化

注：A肝肿大淤血表面有灰白色坏死点；B肺脏充血出血；C脾脏肿大淤血；D心肌出血；E纤维素心包炎。

2.5药敏试验结果（见表5)

由表5可知，3株细菌对四环素、氟苯尼考的耐药率高达100%，对磺胺异恶唑、氧氟沙星的耐药率大于66.7%，对恩诺沙星的耐药率为33.3%，而对庆大霉素、头孢噻呋、黏杆菌素、氨苄西林、大观霉素、安普霉素高度敏感。

表5药敏试验结果

注：S为敏感；I为中介（—表示无标准）；R为耐药。

3、讨论

据统计，每年全球大约有9400万人感染沙门氏菌，其中85%是由动物源性食品感染引起[7,8]。本研究从辽宁省营口市某鹅场发病雏鹅病料中分离到3株鹅源沙门氏菌，确定发病病原为鹅沙门氏菌。据调查，辽宁省同类型发病鹅场较多，危害严重[9]。

沙门氏菌对不同种类的家禽有不同程度的侵袭性和致病性。肉鸡、蛋鸡、鸭、鹅和鸽子等沙门氏菌感染均有报道[10,11,12]。禽类沙门氏菌感染的病理学变化趋于一致，病理结果多为肝脏淤血肿大、肠管充血粘连等现象。本试验小鼠和雏鹅的致病性和病理学试验，发现小鼠和雏鹅死亡率在80%以上，器官组织病变明显。说明分离的鹅沙门氏菌不仅对鹅具有致病性，对哺乳动物也有较强的致病性。因此，养殖场应严格防鼠管理，防止通过小鼠导致沙门氏菌的传播。

目前，养殖场抗生素滥用问题严峻，导致沙门氏菌的耐药性不断增强，临床治疗效果越来越差[13,14,15,16]。2018年，从山东省9个养鸭场分离出36株沙门氏菌进行药物敏感性试验，结果显示，仅对头孢类药物敏感[17]。本研究结果显示，分离菌株对四环素、氟苯尼考的耐药率高达100%，对磺胺异恶唑、氧氟沙星的耐药性均大于66.7%，对恩诺沙星的耐药率为33.3%，而对庆大霉素、头孢噻呋、黏杆菌素、氨苄西林、大观霉素、安普霉素高度敏感。由此可见，选择优势血清型研制优质疫苗、规范药物治疗、科学防控疫病、开发新型绿色抗菌药物等对耐药性的进一步恶性发展具有重要意义。

4、结论

从辽宁省营口市某养鹅场发病鹅腹泻病料中成功分离鉴定3株鹅源沙门氏菌，分离的沙门氏菌对鹅和小鼠均有较强的致病性。沙门氏菌对四环素、氟苯尼考、磺胺异恶唑、氧氟沙星、恩诺沙星等多种抗菌药物产生了耐药性；对庆大霉素、头孢噻呋、黏杆菌素等抗菌药物保持高度敏感。

参考文献：

[1]曲云英.鹅沙门氏菌病的流行病学､症状､实验室诊断及防控[J].现代畜牧科技,2018,37(11):65.

[2]吴昌宏,胡祖余.皖西白鹅沙门氏菌病的诊治[J].兽医导刊,2019(13):76.

[3]龚慧.雏鹅沙门氏菌病综合防治[J].四川畜牧兽医,2020,47(2):57.

[4]成建.鹅沙门氏菌病的诊治[J].农业灾害研究,2016,6(3):14-15.

[5]齐艳阳.鹅沙门氏菌病的诊断与治疗[J].吉林畜牧兽医,2019,40(3):36.

[6]冯文喆,金菊,王崟,等.鹅沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].畜牧兽医科技信息,2018(6):27-28.

[9]李晓双.辽宁部分鹅场沙门氏菌的分离鉴定及耐药性的分析[D].沈阳:沈阳农业大学,2016.

[10]董萌萌,王晓斐,徐彦召,等.1例鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析[J].中国畜牧兽医,2018,45(9):2637-2644.

[11]彭峻烽,曾杭,吴思凡,等.成都地区鸭源沙门氏菌的分离鉴定及其耐药特征､毒力基因分析[J].中国人兽共患病学报,2018(3):217-223.