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猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断探究

2020-12-30 265 上传者：管理员

摘要：为查明贵州省仁怀市某养猪场仔猪发病死亡的原因，采集病死猪病料进行细菌分离培养，以及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒核酸检测。结果:病料中未分离出细菌;猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型核酸检测均为阳性，猪瘟病毒核酸检测为阴性。结论:猪场病例存在猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型混合感染。

关键词：
兽医兽药
实验室诊断
混合感染
猪圆环病毒2型
猪繁殖与呼吸综合征病毒
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2020年3月，贵州省仁怀市某养殖场仔猪陆续出现不明原因死亡病例，病猪初期出现食欲减退、消瘦、生长缓慢、喘气、咳嗽等症状，随后发生急性死亡。该场共有仔猪600余头，1个月内相继发病仔猪20头，死亡16头，发病率3.33%(20/600)，病死率80%(16/20)。为了查明病因，特进行实验室病原学检测诊断。

1、材料与方法

1.1检测病料

无菌采集2头病死仔猪的新鲜心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结作为检测病料。

1.2主要试剂及仪器

(1)主要试剂:猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用型实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测试剂盒、猪瘟病毒(CSFV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨公司)，DNA/RNA提取试剂盒、DL2000DNAMarker试剂(购自大连宝生物工程有限公司)，鲜血营养琼脂培养基(购自杭州微生物试剂有限公司)。(2)主要仪器:荧光定量PCR仪Line-genek(购自杭州博日科技有限公司)、电泳凝胶成像仪SYGENE(购自Gene公司)。

1.3细菌分离培养

无菌操作取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏新鲜组织样品，分别划线接种鲜血营养琼脂培养基，37℃培养24h，观察细菌分离培养结果。

1.4组织样品DNA、RNA提取

取肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结病料各1g于灭菌研钵，加入生理盐水1.5mL快速研磨，匀浆后转入1.5mL灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液100μL，按说明书方法用DNA/RNA试剂盒室温环境提取总DNA和RNA。

1.5相关病毒核酸检测

1.5.1PRRSV核酸检测

以提取的总RNA为模板，构建RT-PCR反应体系25μL:无菌无核酸酶水5μL,RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1.0μL，荧光探针4.5μL，模板RNA2μL。反应条件:42℃5min,95℃10s;95℃5s,60℃35s，共40个循环，在每次循环第2步收集荧光信号。根据阳性对照标准，以Cq值≤35并出现特定的扩增曲线判定为阳性。

1.5.2CSFV核酸检测

以提取的总RNA为模板，构建RT-PCR反应体系25μL:无菌无核酸酶水7.1μL,RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1.0μL，荧光探针2.4μL，模板RNA2μL。反应条件:42℃5min,95℃10s;95℃5s,60℃35s，共40个循环，在每次循环第2步收集荧光信号。根据阳性对照标准，以Cq值≤30并出现特定的扩增曲线判定为阳性。

1.5.3猪圆环病毒2型(PCV-2)核酸检测

以提取的总DNA为模板，采用PCR方法进行PCV-2检测。PCR扩增体系25μL:2×TaqMixture12.5μL,10μmol/L上、下游引物(PCV2-P1:5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’;PCV2-P2:5’-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’)各1μL，模板DNA2μL，灭菌双蒸水8.5μL。反应条件:94℃3min;94℃30s,56℃30s,72℃45s，共35次;72℃延伸10min。取PCR产物8μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳(110V,25min)，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段353bp)。

2、结果

2.1细菌分离培养

2头仔猪各组织样品中均未分离到细菌，表明无细菌感染。

2.2PRRSV核酸检测

由图1可见:阳性对照Cq值为11，而2份检测样品Cq值均<35且有明显扩增曲线，表明组织样品中存在PRRSV感染。

图1PRRSVqRT-PCR检测结果

2.3CSFV核酸检测

由图2可见:阳性对照Cq值为20，而2份检测样品Cq值均>30，且无明显扩增曲线，说明组织样品中不存在CSFV感染。

图2CSFVqRT-PCR检测结果

2.4PCV-2核酸检测

由图3可见:2份检测样品PCR扩增均出现353bp目的基因片段，与阳性对照相符，表明存在PCV-2感染。

图3PCV-2PCR检测结果

3、结论

通过对病死仔猪病料进行细菌分离鉴定和相关病毒核酸检测，确诊该猪场病例存在猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型混合感染。

4、讨论

由PRRSV引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是1种急性高致死性传染病，主要引起母猪繁殖障碍、仔猪肺炎等[1]。PCV-2是圆环病毒科，圆环病毒属的1种无囊膜、共价闭环单股DNA病毒(ssDNA)，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征以及生殖系统疾病[3,3]。近年来，猪的疫病日趋复杂，混合感染也越来越普遍，尤其是PRRSV、PCV-2混合感染最为严重[4]。PallaresFJ等[5]对369份临床PMWS病例进行病原分析显示，PRRSV与PCV-2混合感染率达到51.9%，只感染PCV-2的病例仅占1.9%。贾赟等[6]对来自华东地区4省市的67份PCV-2阳性病料进行检测，发现较严重的二重感染，其中PRRSV与PCV-2二重混合感染占样品总数的52.3%。罗黛青[7]检测发现，云南省东川地区猪疫病的单纯感染情况越来越少，混合感染越来越多，CSFV和PRRSV混合感染呈上升趋势。由此可见，猪群中PRRSV与PCV-2的混合感染已非常普遍，已成为严重危害猪群的混合感染性疫病。PCV-2和PRRSV均属于免疫抑制性病毒，猪群感染后免疫系统受损，免疫机能下降，二者的协同并发加重了猪免疫机能下降的程度，易造成其他疫病的继发感染，严重影响生猪生产[8]。

参考文献：

[1]李晖.猪繁殖与呼吸综合征的监测及其防控[J].福建畜牧兽医,2020,42(3):8-10,14.

[3]赵晓云,乔稳,陈瑾,等.利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗[J].中国农业科学,2015,48(5):976-986.

[4]王慧,宋宏晓,师丽刚,等.猪繁殖与吸综合征､猪圆环病毒2型､猪伪狂犬病病毒混合感染的检测分析[J].中国畜牧兽医,2012,39(9):173-177.

[6]贾赟,芦银华,张素芳,等.猪圆环病2型､猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查[J].中国病毒学,2004,19(5):39-42.

[7]罗黛青.猪蓝耳病与其他疾病混合感染诊断和防控措施[J].中国畜牧兽医文摘,2015,31(2):110.

[8]倪芳文.猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型混合感染的诊治[J].中国动物保健,2019,21(12):59-60.

张倩倩,杨鹏,陈静,尹德晶,程振涛.猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染病例的实验室诊断[J].贵州畜牧兽医,2020,44(06):46-48.

基金:“贵州省动物生物制品工程技术研究中心”贵州省科技平台及人才团队计划(黔科合平台人才[2018]5253号)