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一例鹅病毒性痛风诊断

2023-07-06 105 上传者：管理员

摘要：2018年以来，灌云县及周边县市的肉鹅养殖户所饲养的雏鹅群暴发了以皮下及部分内脏器官表面尿酸盐沉积为特征的痛风症状，经研究表明，近期雏鹅痛风的病原是一种新型鹅星状病毒，给养鹅业造成极大损失，为区别于传统认知的鹅痛风（营养及代谢障碍引起的），有必要暂定为鹅病毒性痛风。本文拟对雏鹅病毒性痛风从病原学、流行病学、临床症状、病理变化、诊断及综合防治措施等方面进行详细说明，以供参考。

关键词：
病毒性痛风
肉鹅养殖
防控
雏鹅
鹅星状病毒
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鹅病毒性痛风是由新型鹅星状病毒引起的一种以鹅的心包、皮下、肝脏等内脏及关节出现大量尿酸沉积为主要特征的急性传染性疾病，造成鹅的大量死亡，给养鹅业带来巨大的经济损失[1,2]。该病于1980年首次被McNulty等从患腹泻和死亡的11日龄雏火鸡的肠内容物中检出星状病毒；1965年，英国学者Asplin发现了禽星状病毒，但是受限于当时的研究条件，并未将其命名为星状病毒；1985年，Gough等才将该病毒鉴定并命名为鸭肝炎病毒2型，确定为鸭星状病毒1型；后于1969年在美国发现的DHV-3，直到2009年才被确认为鸭星状病毒2型；我国于2014年首次报道该病，2017年2月，我国暴发了一种主要引起雏鹅痛风症状的传染病，经多位学者的初步研究证实，该次疫病的主要病原为鹅星状病毒（AstV)[3]。该病主要发生在4～20日龄的雏鹅，最早可发生在1日龄。日龄越小，发病率越高，死亡率也越高[4,5]。主要通过消化道和呼吸道等进行水平传播的新型鹅星状病毒，也可通过种蛋发生垂直传播[6]。本病一年四季均可发生，以冬春季节多发，其他时间较少发生，每年11月至次年5月份为高发季节。

新型鹅星状病毒（goose astrovirus,GAstV）属于星状病毒科禽星状病毒属，是一类无囊膜的正链单股RNA病毒，基因组全长为6.9～7.9 kb。在电子显微镜下可以观察到病毒表面有5～6个突起，结构呈球形，直径大约28～30 nm。该病毒在自然条件下较为稳定，可在4℃条件下稳定存活数月之久。研究发现，我国现流行的新型鹅星状病毒被分为两个基因型群组，两个群组之间同源性小于80%，有研究人员将两群组划分为GAstV-1及GAstV-2。已有学者从发病雏鹅体内成功分离出GAstV-2，经动物回归实验证明其能引起痛风[7]。

近年来，灌云县及周边市县肉鹅养殖户反映痛风病发病率有增长的趋势，该病已成为限制肉鹅产业发展的疾病之一。引起该病发生的因素很多，除了新型鹅星状病毒外，还包含传统认知的鹅痛风（指体内蛋白质代谢障碍和肾功能障碍所引起的营养代谢疾病，其发病原因是蛋白质含量过高的饲料长时间摄入致使肾功能障碍，继而尿酸盐沉积在部分脏器上，如肾脏、输尿管等），此外不佳的饲养环境、失衡的肠道菌群也是该病发生的诱因。

本文所述肉鹅养殖场在饲料、饲养管理环节加以改善后，鹅群仍发生了痛风病，由此怀疑是由新型鹅星状病毒引起的。现就其中1例鹅痛风诊断报告如下。

1、发病情况

2020年5月23日，沭阳县韩山镇张姓养殖户饲养的雏鹅近4天死亡约600只，在当地治疗无效后，来笔者处诊断。主诉：5月5日，从该县某肉鹅炕孵厂购进8 500只鹅苗，全部用某饲料集团肉鹅专用颗粒饲料喂养；第1、10日龄时接种过小鹅瘟抗体，13日龄时发现部分鹅苗采食量减少、有的鹅苗不愿活动或呆立，次日早晨巡查发现鹅苗死亡50余只，经当地兽医诊断，疑似肉鹅痛风，用通肾抗痛风药物进行治疗，未见效果，3 d共死亡近540只（其中治疗当日死亡110只，次日死亡210只）。

经问询后分析，张姓养殖户长期从事肉鹅养殖，鹅苗发病不存在饲养管理原因导致的挤压等非疾病因素所致死。

2、临床症状

患病的雏鹅表现为精神萎靡，采食量明显下降，直至食欲减退，行动迟缓或不爱走动，腹泻，大便白色稀薄严重，死亡时神经症状不明显。

3、剖检病变

剖检病、死鹅13只，发现病死鹅的皮下可见尿酸盐沉积（13/13），尤其是大腿内侧及腹部皮下覆有明显的白色尿酸盐沉积物（11/13）；心脏表面覆有白色尿酸盐沉积物（13/13），肝脏表面覆有白色尿酸盐沉积物（9/13），肠道等器官表面覆有白色尿酸盐沉积物（13/13），具体剖检情况见图1～5。

4、诊断

4.1初步诊断

通过养殖户交代的发病经过，结合临床症状以及解剖情况，具有皮下、肝脏、心脏等器官部位尿酸盐沉积等典型症状，初步诊断疑似星状病毒引起的鹅痛风。

图1皮下尿酸盐沉积

图2肝脏表面尿酸盐沉积

图4肾脏肿大

图5肠道表面有白色石炭碴样附着物沉积

4.2鉴别诊断

1）饲料源性。剖检可见心、肝、脾、肠系膜被白色尿酸盐似石炭样膜覆盖，肾脏多为不对称性肿大、尿酸盐沉积，输尿管变粗、内有白色尿酸盐沉积，而该病无明显此特征症状。饲料源性痛风无传染性，多显慢性发生，少见集中暴发病例，而该病特征正相反。

2）副伤寒。雏鹅20日龄内易感，表现为精神不振，闭眼，眼睑肿胀，两翅下垂，排石炭状或水样稀粪，常阻塞肛门，鼻流浆液性分泌物，而该病无此特征。

剖检可见肝肿大、表面被纤维素渗出物覆盖，但肝上有淡黄色针尖大坏死灶，而该病无此特征；心包内积有浆液性纤维素渗出物，而该病心包内很少见到积有浆液。

3）禽流感。禽流感发生，常见鹅只脚蹼有出血斑等特征病变，而该病无此特征。剖检可见皮下有黄色半透明的黏液，且呈现面积大，肺淤血，心内外出血或淤血，而该病无此特征。

图3心脏表面尿酸盐沉积

4.3回归实验

无菌操作，取少许病鹅的心脏、肝脏等病料，青霉素和链霉素灭菌，加入生理盐水，粉碎，高速离心分离，提取上清液备用。

取20只1日龄健康雏鹅随机将其分成2组，每组10只。试验组雏鹅经皮下注射提取上清液，0.5 mL/只，对照组雏鹅经皮下注射无菌生理盐水，0.5 mL/只；自注射之日起对鹅群连续观察15 d。

每日观察雏鹅的临床症状，剖检病死雏鹅，可见大腿内侧、腹部皮下、心脏表面、肝脏表面、肠道等覆有白色尿酸盐沉积物，具有该病解剖应有的典型特征症状。

4.4实验室诊断

1）细菌分离。无菌操作取病死雏鹅的肝脏和肾脏组织，接种于普通营养琼脂培养基、马丁琼脂培养基、巧克力琼脂培养基、鲜血琼脂培养基及麦康凯培养基上，接种后放置于37℃恒温培养箱中培养18～24 h，观察有无细菌生长。

在普通营养琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、马丁琼脂培养基、巧克力琼脂培养基及麦康凯培养基上未见可疑菌落，细菌培养结果为阴性。

2）病料采集。无菌操作采集病鹅的心脏、肝脏、肾脏等病变明显器官，进行RT-PCR检测。

3）病毒RNA的提取及RT-PCR检测。

①病毒RNA提取：先将异丙醇放置-20℃预冷，将采集的适量病料放入含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）中进行研磨，将研磨好的病料放入1.5 m L离心管中，反复冻融3次。之后使用离心机，在4℃条件下，设置转速为12 000 r/min，离心3 min。取300μL上清液后，置于干净的1.5 mL EP管中，加入Trizol溶液500μL，轻轻颠倒混匀后室温静置5～7 min；加入三氯甲烷200μL，剧烈混匀15 s后静置5 min;12 000 r/min离心10 min，取上清约400μL至新的RNase-freeEP管中，加入已预冷的异丙醇400μL，颠倒混匀后-20℃静置10 min,12 000 r/min离心10 min，弃去上清液；加入DEPC水配制的70%乙醇800μL，颠倒混匀，12 000 r/min离心10 min，弃上清，室温放置2～5 min。

②RT-PCR：以提取的RNA为模板进行RT-PCR，反应体系为20μL，其中5×RT Buffer(Mg2+) 4μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 4μL，六碱基随机引物（50μmol)1μL，反转录酶（200 U/μL)1μL,RI(40U/μL) 0.5μL,DEPC水9.5μL。RT-PCR反应程序为：将反转录体系先放置25℃金属浴中10 min，接着放置42℃水浴锅中反转录1 h，然后放置70℃金属浴中10 min对反转录酶灭活，最后可将反转录产物cDNA置于-20℃保存。

③PCR检测：根据RNA依赖型RNA聚合酶（ORF1b），用Primer 5.0设计一对通用检测引物，引物序列如下：上游引物F为5′-CGCTTYGATGGNATHCC-3′；下游引物R为5′-GGYTTKACC-CACATNCCRAA-3′。产物大小428 bp，引物设计完成后交由南京金斯瑞生物技术有限公司进行合成公司合成。

以上述cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL，其中cDNA 1μL,10×TransTaq®Buffer (Mg2+) 2.5μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 2.5μL,TransTaq®DNA polymerase(5 U/μL) 0.5μL，上下游引物（10 mol/L）各0.5μL,ddH2O 18μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸适当时间30 s，进行30个循环；72℃延伸10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶，电泳条件为恒定电压110 V，时间30 min，之后使用凝胶成像仪进行观察。

图6 PCR鉴定电泳图

4) PCR检测结果。利用合成的引物，以提取到的病毒cDNA为模板，扩增出明亮的428 bp大小的目的片段，且片段大小与预期一致（图6）。PCR产物送公司测序，证实有鹅星状病毒感染。

结合发病情况、临床症状、剖检病变、鉴别诊断及实验室PCR方法诊断，确诊该病为鹅病毒性痛风。

5、防治措施

5.1治疗方案

未见该病治疗确切方案报道，但经笔者组方用药，对该病例及前后确诊的23例该类病例进行了治疗，取得有明确的治疗效果。

将10%氟苯尼考、10%安普霉素和“激活”（饲料添加剂，主要成分为屎肠球菌及中草药发酵产物）混合兑水，前3 d按照说明书建议用量的2倍饮水治疗，早晚2次；后续2 d按照说明书建议用量使用，巩固治疗效果。通过上述组方治疗，用药2 d后，大群鹅中未发现新增病例；用药3 d后，未死亡病鹅也已基本康复。

5.2预防措施

雏鹅星状病毒感染引起的痛风病主要通过粪-口传播，采用地上网架饲养或多层笼养等育雏模式，可以有效减少和粪便污染过的饲料及水源的接触，从而降低感染病原的几率。

1）场地用具消毒。空置的栏舍分别用过氧乙酸、2%氢氧化钠先后全面各喷洒一次，食具等设备用2%氢氧化钠溶液浸泡1～2 d后，先清水洗涤清洁干净，再用消毒剂如聚维酮碘等喷洒1次，晾干后备用。

2）带鹅舍常规消毒。夏季带鹅喷雾消毒1次/3d，秋冬季带鹅喷雾消毒1次/7d；发病时，每天带鹅喷雾消毒1～2次，经常使用过氧乙酸、聚维酮碘等带鹅消毒药，浓度的选择一般按说明书的规定。

3）饲养场地消毒。要定期对饲养场周边环境进行清扫、消毒，一般保持1次/10d。