RAS-GTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras GTase-activating protein SH3 domain binding protein 1,G3BP1）是一种在生物进化过程中高度保守的宿主蛋白[1,2,3]。G3BP1蛋白全长466个氨基酸，由N端的NTF2-like结构域（nuclear transport factor 2-like domain）、酸性富集区结构域（acidic rich region domain）、Pxx P基序结构域（proline-rich Pxx P motif domain）、RRM基序结构域（RNA recognition motif domain）和C端的RGG结构域（arginine-glycine-glycinedomain）组成[1,2,3]。G3BP1具有结合RNA活性、ds DNA/ds RNA解旋酶活性、RNase活性和诱导应激颗粒（stressgranules,SGs）形成，以及参与细胞的生长、分化、凋亡、代谢和免疫等生物学过程[1,2,3]。

当细胞受到环境、病毒感染等应激压力下，G3BP1转移m RNA并与核糖核蛋白、RNA结合蛋白等多种蛋白聚合，在细胞质内形成致密颗粒状的SGs，进而抑制翻译和多聚核糖体解离，动态地与细胞质发生物质交换，维持细胞稳态[1,2,3]。此外，近年的研究发现，G3BP1作为核酸识别受体的调控因子，主要通过四种调控方式发挥抗病毒天然免疫作用：一是G3BP1通过促进SGs的组装，限制病毒RNA在SGs中，进而阻止病毒RNA在宿主细胞中的转录与翻译，从而发挥抗病毒作用[1,2,3,4]；二是G3BP1通过促进RNA识别受体如RIG-I、MDA5、PKR等在SGs中对外源RNA感应和结合以及对关键接头分子VISA的招募，激活ISGs的表达，进而抑制病毒的感染与复制[1,2,3,5,6,7,8,9]；三是SGs中的G3BP1通过募集核酸酶如OAS-RNase L、TREX1等降解外源或部分内源核酸，限制病毒的复制[1,3,9,10,11]；四是G3BP1通过液-液相分离方式促进了DNA与c GAS形成液相凝聚物，进而促进了c GAS对DNA结合、c GAS的活化、STING的多聚化、IRF3/7和NF-κB磷酸化、IFN-β的分泌以及ISGs的表达，这表明G3BP1独立于SGs作为细胞面对病毒感染的反应平台，在宿主抗DNA病毒的感染中发挥重要作用[1,2,3,12,13,14]。虽然c GAS在没有辅助蛋白的情况下也能催化产生第二信使分子2′3′-c GAMP，但目前尚未有证据证实G3BP1能够直接促进c GAS介导的酶促反应，从而提高2′3′-c GAMP的合成效率。

因此，本文通过构建牛G3BP1(b G3BP1)基因的原核表达载体，对其进行体外诱导表达，获得了高纯度、高浓度和高活性的重组蛋白b G3BP1，进而证实了b G3BP1能够显著提高牛c GAS(bc GAS)酶催化生成2′3′-c GAMP，这为后续牛源2′3′-c GAMP的大规模生产和应用奠定了一定的技术方法。

1、材料与方法

1.1 材料

表达载体p ET28a-SUMO和bc GAS重组蛋白为本实验室保存。DL2000 DNA分子质量标准、GXL聚合酶、c DNA逆转录试剂盒和DH5α克隆菌均购自宝生物工程（大连）有限公司。胶回收试剂盒和纯化试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。大提质粒试剂盒和Rosetta(DE3）表达菌均购自北京天根生化科技有限公司。IPTG购自美国西格玛奥德里奇（中国）生物公司。SUMO蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国赛默飞世尔（中国）生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

根据NCBI网站登载的奶牛G3BP1(XM＿005209645.4）基因序列，应用引物设计软件Premer 5.0设计b G3BP1全长基因的扩增引物（表1），由西安擎科生物技术有限公司合成。  

表1 b G3BP1全长基因引物设计  

1.2.2 b G3BP1基因的PCR扩增

Trizol提取法提取牛血液淋巴细胞中的总RNA后转录成c DNA，经PCR扩增出b G3BP1的全长序列，并将琼脂糖凝胶电泳后的目的片段进行胶回收、纯化。PCR反应体系：GXL Buffer 5μL,GXL 0.5μL,d NTP 2μL,F1/R1各0.5μL,b G3BP1模板1μL,DEPC水15.5μL。

1.2.3 重组质粒b G3BP1的构建与鉴定

使用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶分别酶切原核表达载体和目的基因b G3BP1，在16℃的水浴中连接12～16 h，然后将连接产物转化至DH5α克隆菌中。次日，挑取单克隆菌落至LB培养液中培养16 h，提取重组质粒并送至西安擎科生物技术有限公司进行测序，将测序正确的重组质粒命名为p ET28a-SUMO-b G3BP1。

1.2.4 b G3BP1重组蛋白的诱导表达、条件优化和鉴定将鉴定

正确的重组表达质粒转化至Rosetta(DE3）表达菌中过夜培养。次日，挑取单克隆菌落至5 m L的LB液体培养基中，于37℃、200 r/min的恒温摇床中培养16 h，再以1∶100的比例接种到新的LB液体培养基中，当菌体生长至对数期时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。此外，对重组表达菌的接种量、IPTG浓度、温度、表达时间、转速等参数进行优化，筛选出了最优的参数组合，并应用SDS-PAGE和Western-blot对收集、制备的重组表达样品进行鉴定。

1.2.5 b G3BP1重组蛋白的纯化与酶切

采用可溶性表达最佳的参数组合诱导表达b G3BP1重组蛋白，继而进行超声破碎，收集上清液进行镍柱亲和层析纯化，其中样品与镍琼脂糖凝胶FF填料的比例为5∶1，镍柱配体与重组表达载体上的组氨酸标签蛋白发生特异性结合，而其他非目的蛋白不与镍柱结合而进入流穿液中，使用高浓度咪唑液洗脱时目的蛋白随之被洗脱下来。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定，将含量较高的目的蛋白洗脱液进行超滤浓缩后切除His6-SUMO标签。酶切体系为：1 mg重组蛋白G3BP1,20μL蛋白酶Buffer缓冲液，2μL蛋白酶，dd H2O定容至1 m L,4℃酶切过夜。酶切后的样品进一步经镍柱亲和层析纯化，将获得的蛋白在透析缓冲液中透析14～16 h，取样进行SDS-PAGE鉴定并测蛋白浓度，其余样品保存于-80℃。

1.2.6 b G3BP1对bc GAS酶活性的影响

为了直接评价b G3BP1对bc GAS酶活性的影响，本研究进行了c GAMP体外酶促合成反应，在试验体系中加入HT-DNA、ATP、GTP以及前期体外纯化的bc GAS重组蛋白，设置两组总体积为1 m L的酶促反应体系：一组为不加b G3BP1酶促反应组（1 m L体系）：160μg bc GAS,1 mol/L的20μL HEPES和5μL Mg Cl2,100mmol/L的20μL ATP和20μL GTP,10 mg/m L的10μL HT-DNA；第二组为加b G3BP1酶促反应组（体系）：160μg bc GAS,160μg b G3BP1,1 mol/L的20μL HEPES和5μL Mg Cl2,100 mmol/L的20μL ATP和20μL GTP,10 mg/m L的10μL HT-DNA。反应程序为：37℃水浴中孵育6 h，反应结束后加入50μL Benzonase，随后于37℃水浴中孵育30 min,95℃恒温水浴中孵育10 min,-20℃以下存放24 h以上，进而4℃、16 500 r/min离心10～15 min，取离心上清液保存至-80℃备用，使用2′3′-c GAMP试剂盒对酶促产物进行定性与定量分析。

2、结果

2.1 b G3BP1基因克隆

以奶牛淋巴细胞c DNA为模板，扩增出目的基因b G3BP1，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示，目的片段大小约1 400 bp，与目的基因大小基本一致（图1）。

图1 b G3BP1基因全长的克隆  

2.2 重组质粒的测序鉴定

将b G3BP1基因全长克隆到载体p ET-28a-SUMO上，并将其送至西安擎科生物技术有限公司测序，测序结果显示正确。

2.3 b G3BP1重组蛋白的诱导表达和Western-blot检测

收集对数生长期诱导和未诱导组样本进行SDS-PAGE鉴定，结果发现与未诱导组相比，诱导组在88 ku左右处出现明显的条带（图2A）。Westernblot试验结果发现，在88 ku左右处出现了一条特异性条带（图2B），说明成功诱导表达了b G3BP1重组蛋白。

图2 重组蛋白鉴定   

2.4 重组融合蛋白的表达形式

当在37℃诱导时，收集的菌体经过超声波细胞破碎机破碎后，发现b G3BP1主要存在于菌体破碎的沉淀中，上清中较少（图3A）；通过降低温度，最终在18℃、120 r/min、IPTG浓度为0.3 mmol/L、诱导16 h时，重组蛋白主要以可溶性形式表达并存在于上清中（图3B）。

图3 重组蛋白在不同条件下的表达   

2.5 重组蛋白的纯化与酶切

经镍柱亲和层析纯化后的b G3BP1重组蛋白（图4A），切除标签蛋白后，经镍柱再纯化后的目的b G3BP1（图4B）。结果表明，切除His6-SUMO标签后目的蛋白的大小与预期相符。

图4 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE分析   

2.6 b G3BP1对bc GAS酶活性的影响

利用2′3′-c GAMP试剂盒对酶促产物进行定性与定量分析。结果发现，酶促反应体系不同，2′3′-c GAMP的产量也不同且差异显著，表明b G3BP1能显著提高2′3′-c GAMP的产量（图5）。

3、讨论

G3BP1是最早发现的一种在SGs形成中所必须的蛋白，参与了SGs成核的过程[1,2,3]。当病毒入侵宿主细胞后导致平衡紊乱，应激压力积累而引起翻译起始因子e IF2α的磷酸化，阻止了e IF2-GTP-Met-t R-NAi复合物的形成，宿主与病毒的蛋白翻译被抑制，进而未翻译的m RNA结合翻译起始因子前体和RNA结合蛋白组装SGs，以控制细胞自身的翻译水平，从而在宿主抗病毒蛋白上调之前就能快速抑制病毒的复制[1,2,3]。因此，G3BP1介导的应激颗粒的形成是宿主细胞的一种重要的抗病毒天然免疫防御机制。此外，近些年的研究发现，G3BP1在核酸感应器介导的抗病毒天然免疫中也扮演了重要角色。当RNA病毒如HIV、EV71、仙台病毒、水疱性口炎病毒、猪流行性腹泻病毒、塞内卡病毒、新冠病毒等感染宿主细胞时，一方面以G3BP1为桥梁促进胞质RNA识别受体RIG-I、MDA5、LGP2、DDX3对病毒的RNA感应与结合，随后病毒的RNA、PRRs、接头分子VISA、信号分子TRAF2/5、调节分子TRIM25、Riplet、PQBP1和RNF125等被招募到SGs,SG进而作为反应平台，增强宿主细胞中干扰素的表达和分泌，从而限制病毒的复制[1,2,3,5,6,7,15,16,17]；另一方面G3BP1通过OAS-RNase L促进PKR对病毒RNA的结合，引起e IF2α的磷酸化和SGs形成，促使PKR被招募到SGs中，阻止病毒蛋白翻译，以及通过活化核转录因子NF-κB、JNK，诱导炎症因子的分泌，进而抑制病毒的复制[1,2,3,8,9,10,11]。进一步研究发现，当痘苗病毒感染宿主细胞时，G3BP1与c GAS复合物提高了c GAS对DNA结合能力，促进了PKR和e IF2α的磷酸化，分别引起G3BP1介导的SGs和液相凝聚物形成，进而诱导Ⅰ型干扰素的分泌[1,2,3,18]；相反，当HSV-1、巨细胞病毒等DNA病毒感染宿主细胞时，G3BP1通过液-液相分离方式与c GAS形成了液相凝聚物，增加了c GAS对DNA结合能力，促进了c GAS的活化和c GAMP产生，但是并未有SGs的组装[1,2,3,12,13,14,19,20,21]。尽管如此，该研究仅从细胞水平间接证实了G3BP1通过c GAS促进了c GAMP的产生，但是目前尚不清楚G3BP1是否直接促进c GAS的酶活性并提高c GAMP的合成效率，以及是否还有其他辅助免疫分子也参与此过程。

图5 2′3′-c GAMP浓度   

因此，为了从体外水平直接探讨b G3BP1对bc GAS生物酶活性的影响，本试验首先构建了b G3BP1的原核表达载体，随后，通过对诱导条件如温度、IPTG的浓度、时间和转速等的探索，最终筛选出b G3BP1可溶性表达的最佳参数组合。此外，为了消除SUMO标签可能对目的蛋白正确折叠和构象影响，保证其生物酶活性，通过ULP酶将其切除后再纯化，得到了浓度和纯度均较高的目的蛋白。随后，将b G3BP1蛋白用于bc GAS的体外酶促合成反应中，探索了b G3BP1对bc GAS酶促合成反应的影响。结果表明，仅有bc GAS酶促合成c GAMP的浓度显著低于含有b G3BP1参与的酶促合成反应中c GAMP的浓度，这一结果说明b G3BP1能够增加bc GAS的催化活性并显著提高c GAMP的浓度。虽然标签蛋白可能影响目的蛋白的正确折叠、构象和生物活性，但是我们前期的研究表明SUMO标签不仅不影响bc GAS酶的生物学活性，还可能对bc GAS蛋白具有稳定保护作用。因此，我们的后续试验还需要进一步确定SUMO标签是否对b G3BP1的生物学活性有影响，以及进一步优化b G3BP1和bc GAS的表达、纯化条件以及2′3′-c GAMP的最佳制备条件与方法，从而提高2′3′-c GAMP的产率和免疫刺激活性，为后续c GAMP大规模生产以及应用奠定基础。

4、结论

本研究成功构建了牛源b G3BP1的可溶性原核表达载体，并获得了浓度、纯度和活性均较高的重组蛋白b G3BP1，同时发现b G3BP1能够提高bc GAS的酶活性和2′3′-c GAMP的产率。本研究为b G3BP1的原核表达、分离纯化、提高c GAMP酶促合成效率提供了研究思路和技术方法，也为后续c GAMP的大规模合成和应用奠定了一定基础。

基金资助:新疆动物疫病研究重点实验室开放基金项目(2023KLB003);甘肃省自然科学基金项目(20JR10RA018,17JR5RA325);

文章来源:田慧慧,何小兵,陈国华等.牛G3BP1蛋白的原核表达及其对牛cGAS生物酶催化活性的影响[J].中国兽医科学,2023,53(12):1531-1536.