干扰素(interferon,IFN)是一类具有种属特异性的细胞因子，具有抑制病毒、免疫调节和抑制肿瘤功能(Meager,2002)。根据干扰素的结构特点，可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型IFN包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-τ和IFN-ζ等13种不同亚型，机体产生的IFN-α活性较高，具有抑制病毒增殖增强和机体细胞免疫应答水平等功能(Johnson et al.,1994)；Ⅱ型IFN只有IFN-γ 1个成员，具有免疫调节功能；Ⅲ型包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，具有抗病毒和免疫增强作用(Capobian‐chi et al.,2015)。

细胞因子包括Th1型和Th2型细胞因子，Th1型细胞因子主要有白细胞介素(interleukin,IL)-2(IL-2)、IL-12、IL-18、IFN-γ和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等，可以促进机体细胞免疫应答；Th2型细胞因子包括IL-4、IL-6、IL-10和IL-13等，可以促进机体体液免疫应答(Romagnani,1999)。IL-2可诱导激活机体T淋巴细胞和B淋巴细胞，发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能(Tagu‐chi,1994)。

自Lefevre和La Bonnardiere (1986)克隆到Po IFN-α基因以来，国内外学者围绕猪(Sus scrofa)α干扰素表达、纯化等方面开展了一系列的研究。陈涛(2002)以包涵体形式表达了Po IFN-α蛋白，其在人羊膜细胞(human amniotic cells,WISH)细胞上抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到5 200 U/mg;Huang等(2005)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达r Po IFNα蛋白，在WISH细胞上抑制VSV的活性达到2.1×104 IU/m L;Zhao等(2017)在大肠杆菌(Escherichia coli)中可溶性表达、纯化Po IFN-α，在人喉表皮样癌细胞HEp-2上抑制VSV的比活达到1×106 IU/mg。Goodall等(1991)克隆Po IL-2的c DNA，随后Collins等(1994)、Iwata等(2000)分别在杆状病毒表达系统、E.coli表达体系中表达了r Po IL-2蛋白，重组蛋白在小鼠(Mus musculus) T淋巴细胞增殖反应中显示出高生物学活性。本课题组前期已成功构建了r Po IFN-α-linker-Po IL-2嵌合基因，并在原核表达系统中以包涵体形式进行了重组表达，初步证明得到的r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在体外同时具有猪α干扰素和猪白介素2蛋白的生物学活性(闫若潜等,2009)，为进一步开展重组蛋白体内抑制病毒感染研究提供了基础。但关于r Po IFN-α和r Po IL-2蛋白联合可溶性的表达未见报道。

以包涵体形式表达的蛋白质需要经过多步骤的变性过程才可获得少量的活性蛋白，生产成本很高(Yin et al.,2007)。以可溶性形式表达的r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白，无需再变性、复性就具有生物活性。通过一步法纯化可以获得高纯度的重组蛋白，下游纯化过程简单，便于工业化生产。因此，研究r Po IFN-α-linker-Po IL-2的可溶性表达具有积极意义。本研究在课题组前期研究基础上根据大肠杆菌稀有密码子的偏嗜性，对Po IFN-α-linker-Po IL-2嵌合基因进行表达蛋白可溶性人工改造，以实现重组蛋白的可溶性表达并测定其在不同细胞上抑制不同病毒(猪肾细胞(porcine kidney cells,PK)-15/水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV),PK-15/伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV),WISH/VSV,PK-15/塞内卡病毒(Seneca virus,SVA),非洲绿猴肾细胞(Verda Reno,Vero)/猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV))的增殖活性，以期为进一步研究r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在猪体内抑制病毒增殖活性及以该蛋白为主要成分的抗病毒药物提供基础资料。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂、细胞与病毒

限制性内切酶Eco RⅠ、HindⅢ、DL2000 DNA分子标记、DL5000 DNA分子标记、大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)感受态细胞等购自Ta Ka Ra (北京)有限公司；LB Broth购自北京酷来搏科技有限公司；镍铬亲和层析柱购自嘉兴千纯生物科技有限公司；Triton X-114、4×蛋白上样缓冲液、异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、氨苄青霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA购自北京索莱宝科技有限公司；Sure PAGE™预制胶、Tox‐in Sensor™显色法LAL内毒素检测试剂盒购自南京金斯瑞生物科技公司；Porcine IFN-α ELISA检测试剂盒、Porcine IL-2 ELISA检测试剂盒购自江苏酶免实业有限公司(盐城)；DMEM培养基购自博士德生物公司(武汉)；三色预染蛋白分子量标准购自Genview生物技术有限责任公司(北京)；人重组白细胞介素2 (rh IL-2)标准品购自美国PEPROTECH公司；商品化猪α干扰素购自四川世红生物技术有限公司；表达载体p ET-32a(+)、VSV、PRV、SVA和PEDV均由本实验室提供。

1.1.2 主要仪器设备

Trans-Blot Turbo Biored蛋白转印系统购自美国伯乐生命医学产品有限公司；凝胶成像分析系统为美国Protein Simple公司产品；倒置荧光显微镜为日本尼康公司产品；超声波细胞破碎仪为美国Son‐ics公司产品；高速冷冻离心机为德国SIGMA离心机有限公司产品；PCR仪、恒温摇床为德国艾本德(eppendorf)股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 r Po IFN-α-linker-Po IL-2基因的可溶性改造与重组质粒的构建

根据大肠杆菌密码子偏好性对Po IFN-α-linkerPo IL-2嵌合基因进行可溶性改造，使之适应于大肠杆菌的可溶性表达。设计一对特异性引物：P1:5'-TCGAATTCTTGTGTGATCTGCCGCAGAC-3';P2:5'-TCAAGCTTTTAGGTCAGGGTGCTATAAATG-3'。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。扩增片段长度为951 bp,PCR反应体系：10μmol/L P1和P2各0.5μL;Ex Taq DNA聚合酶12.5μL；补水至22μL，加入模板DNA 3μL进行PCR。反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,53℃退火1 min,72℃延伸1 min，共5个循环；94℃变性1min,57℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环；72℃延伸10 min。将改造完成的Po IFN-α-linker-Po IL-2嵌合基因亚克隆入表达载体p ET-32a(+)，转化E.coli BL21 (DE3)感受态细胞，筛选阳性rp ET-32a/Po IFN-α-linker-Po IL-2重组表达质粒，对表达质粒进行PCR、双酶切(Eco RⅠ/HindⅢ)鉴定后，将阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

1.2.2 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的可溶性表达及诱导表达条件的优化

挑取鉴定后的重组菌Po IFN-α-linker-Po IL-2/E.coli、BL21空菌、p ET-32a(+)空载体对照进行IPTG浓度、温度、时间诱导表达条件的优化筛选，诱导表达后离心收集菌体沉淀，于-80℃冻融后加入裂解缓冲液，吹打混匀菌体，冰浴超声波裂解、离心，分别收集上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳分析r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的可溶性和包涵体表达情况。

1.2.3 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的纯化及内毒素的去除

采用镍铬亲和层析柱纯化r Po IFN-α-linkerPo IL-2蛋白；用含不同浓度咪唑的缓冲液平衡层析柱、去除杂蛋白、洗脱目的蛋白，并进行SDS-PAGE分析；4℃条件下透析去盐、去咪唑，收集蛋白。包涵体沉淀按照闫若潜等(2009)的方法进行包涵体蛋白的变性、复性和纯化。参照Liu等(1997)报道的方法用Triton X-114抽提去除内毒素，用Toxin‐Sensor™显色法LAL内毒素检测试剂盒检测样品中的内毒素含量。

1.2.4 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的Western blot鉴定

将r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白进行15%SDS-PAGE，将分离的蛋白转移至PVDF膜上，以Porcine IFN-α ELISA检测试剂盒中HRP标记的IFN-α抗体为一抗，Porcine IL-2 ELISA检测试剂盒中HRP标记的IL-2抗体为二抗，进行Western blot分析。

1.2.5 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白促外周T淋巴细胞增殖活性检测

参照闫若潜等(2009)报道，采用淋巴细胞增殖检测法检测r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白促外周血T淋巴细胞(peripheral blood T lymphocyte,PBLC)增殖活性。无菌采集猪外周血并分离外周T淋巴细胞，将细胞在96孔细胞板中培养，对稀释10倍后的r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白、rh IL-2标准品分别进行2倍倍比稀释，100μL/孔，同时设置细胞对照，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，每孔加入20μL MTS/PMS(甲基三氯硅烷/吩嗪硫酸甲酯)混合液，继续培养1～4 h。测定样品OD490值，计算蛋白的相对生物学活性单位。

1.2.6 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白特异性免疫反应活性检测

采用Porcine IFN-α ELISA检测试剂盒、Por‐cine IL-2 ELISA检测试剂盒说明书对5倍稀释r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白进行检测，判定其是否具有免疫学活性，并对r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白中的Po IFN-α、Po IL-2进行相对定量。参照试剂盒说明书进行检测，根据纯化的r Po IFN-α-linkerPo IL-2蛋白、试剂盒猪α干扰素、猪白介素2阳性对照OD450值，计算r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白中猪α干扰素、猪白介素2相对定量。

1.2.7 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒增殖活性检测

将纯化后的r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白经0.22μm滤膜无菌过滤后采用细胞病变抑制法分别测定其在PK-15/VSV、WISH/VSV、PK-15/PRV、PK-15/SVA和Vero/PEDV等不同细胞系上抑制不同病毒增殖的活性，按50%病变计算效价单位。在铺满单层细胞的96孔细胞板中每孔加100μL 2倍倍比稀释的r Po IFN-α-linkerPo IL-2蛋白(稀释至1∶256)，每个稀释度做8个重复孔，同时设正常细胞对照组、病毒对照组。37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，分别在细胞中加入100μL 100半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose,TCID50)的病毒继续培养48h，待病毒对照孔75%以上细胞出现病变时，判定结果。按照现行《中国兽药典》附录Reed-Muench法(Zamoiskii,1956)计算r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在细胞上抑制病毒增殖活性，并与商品化猪α干扰素、包涵体经变性复性纯化后的蛋白进行比较。活性测定实验重复进行多次，确保实验数据的准确、可靠性。

1.2.8 数据统计分析

采用Graph Pad Prism 9.0软件绘图，SPSS 17.0软件对数据进行t检验分析。

2、结果与分析

2.1 rp ET-32a/Po IFN-α-linker-Po IL-2重组表达质粒的构建

阳性重组表达质粒rp ET-32a/Po IFN-α-linkerPo IL-2经PCR鉴定，在951 bp处出现特异性条带(图1A)，经Eco RⅠ和HindⅢ双酶切后分别在5 900(质粒载体)和951 bp出现特异性条带，大小与预期相符(图1B)，阳性克隆重组质粒测序结果正确，表明亚克隆入p ET-32a表达载体中的Po IFN-α-linkerPo IL-2嵌合基因长度与PCR结果一致，核苷酸序列与原基因序列相同，表明rp ET-32a/Po IFN-α-linkerPo IL-2表达质粒构建成功。

2.2 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的可溶性表达

2.2.1 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的表达

Po IFN-α-linker-Po IL-2嵌合基因在E.coli BL21 (DE3)中成功可溶性表达，大小约55 k D，且上清液中可溶性目的蛋白含量明显高于沉淀中目的蛋白含量(图2)，表明经大肠杆菌稀有密码子偏嗜性改造的Po IFN-α-linker-Po IL-2嵌合基因可在E.coli BL21 (DE3)中可溶性大量表达。

图1 rp ET-32a/Po IFN-α-linker-Po IL-2质粒的鉴定   

2.2.2 诱导条件的优化

设置不同的温度、时间及不同的IPTG诱导浓度探索r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白最佳诱导表达条件，结果显示，使用0.2 mmol/L IPTG诱导剂在25℃条件下表达9 h后，可溶性r Po IFN-α-linkerPo IL-2蛋白的表达量最优，之后便趋于稳定(图3)。

2.3 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的纯化

采用镍铬亲和层析柱对r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白纯化后，目的蛋白纯度达90%以上(图4)。

2.4 内毒素的去除

经Toxin Sensor™显色法LAL内毒素检测试剂盒检测，去除内毒素前r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白中的内毒素含量为400 EU/m L，使用Triton X-114后，r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白中的内毒素含量为23.4 EU/m L，低于兽用生物制品规定的50 EU/m L的标准。

图2 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白表达的SDS-PAGE分析   

2.5 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的Western blot鉴定

Western blot鉴定结果(图5)显示，r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白与Po IFN-α抗体、Po IL-2抗体均能发生特异性反应，具有良好的反应原性。

2.6 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白促猪PBLC增殖活性

r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白和人重组白细胞介素2蛋白标准品均能显著提升PBLC增殖活性，根据标准曲线计算r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的促PBLC生物学相对活性单位为4.1×105 IU/m L(图6)。表明r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白中的猪白介素2具有促猪外周T淋巴细胞增殖活性。

图4 纯化的r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白的SDS-PAGE分析   

图3 不同诱导条件下r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白表达产物的SDS-PAGE分析  

2.7 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白特异性免疫反应活性

r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白可以和抗Po IFN-α、抗Po IL-2单抗反应，表明r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白具有与猪α干扰素、猪白介素2单抗发生特异性免疫反应的生物学活性。根据r Po IFN-α-link‐er-Po IL-2蛋白OD450值与试剂盒中猪α干扰素蛋白、猪白介素2蛋白标准曲线(图7)，计算得出r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白中猪α干扰素蛋白的相对含量约为280 pg/m L，猪白介素2蛋白的相对含量约为1 068 pg/m L。

2.8 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒增殖活性检测

根据Reed-Muench法计算r Po IFN-α-linkerPo IL-2可溶性蛋白在PK-15、WISH细胞上抑制VSV的活性单位分别为1.8×106、2.5×106 IU/mg，在PK-15细胞上抑制PRV、SVA的活性单位分别为2.2×104、1.3×105 IU/mg，在Vero细胞上抑制PEDV的活性单位为3.2×104 IU/mg；表明r Po IFN-α-linkerPo IL-2可溶性蛋白在体外对VSV、SVA、PEDV有较高的抑制活性，且活性效价均极显著高于商品化猪α干扰素对照和纯化后的包涵体蛋白(P<0.01),p ET-32a(+)空载体表达的蛋白无活性，表明表达载体蛋白不会对r Po IFN-α-linker-Po IL-2可溶性蛋白效价产生影响(图8;表1)。

图5 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白纯化的Western blot分析  

3、讨论

在“禁抗、限抗、减抗”的背景下，兽用生物制品(疫苗,细胞因子等)因具有无残留、无耐药性、效果好等优点成为当前兽药创制的新热点。近年来，由PRV、PEDV变异株引起的猪伪狂犬病、猪流行性腹泻等病毒性疫病对养猪业危害严重，现有疫苗免疫保护效果差，尚无可有效免疫保护变异株的商品化疫苗；特别是新发疫病不断发生，如非洲猪瘟、塞内卡病毒病等(申水莹等,2021)，国内外均无疫苗可用。目前针对病毒性疫病尚无特效药物可以防治，严重影响养殖业健康发展和畜产品质量安全，基因工程技术可以利用细胞因子基因创制广谱的抗病毒制剂，其无残留、效果优、无毒副作用，成为替代化学合成类抗病毒药物的理想制剂。目前，人类医学领域采用重组IFN-α、IL-2作为广谱抗病毒、抗肿瘤制剂在临床广泛应用(Tossing,2002;Berman et al.,2006;Brivio et al.,2004)，但在兽医临床上目前国内商品化的产品仅有猪白细胞干扰素，尚无基因工程r Po IFN-α和r Po IL-2单一或者联合产品。国内外虽已有多个研究者对重组猪α干扰素、白介素2的表达及体外活性进行研究，但表达产物多以单一包涵体形式存在，表达量不高，需要经过复杂的变性、复性过程，不仅工艺复杂，不利于产业化生产，还会造成大量蛋白损失，导致生物学活性低且不稳定。

图6 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白对猪外周T淋巴细胞(PBLC)增殖活性  

图7 ELISA检测Po IFN-α (A)和Po IL-2 (B)蛋白阳性对照标准品   

图8 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒增殖活性检测   

在本课题组前期已成功构建r Po IFN-α-linkerPo IL-2嵌合基因的基础上，根据大肠杆菌密码子偏嗜性对Po IFN-α-linker-Po IL-2基因进行可溶性改造，利用密码子优化软件根据大肠杆菌偏爱密码子、GC含量及简化m RNA二级结构等方法优化改造目的基因，以增加靶基因的翻译效率，提高蛋白的可溶性表达。采用的p ET-32a(+)表达载体含有T7启动子和转录终止信号，不仅能编码6个组氨酸残基，还带有能编码109个氨基酸的硫氧还原蛋白的E.coli Trx A基因，可以进行蛋白可溶性表达，提高表达蛋白的稳定性，同时便于使用镍铬亲和层析柱纯化(Mirjamali et al.,2014)。本研究筛选出1株目的蛋白可溶性表达量高于包涵体表达的r Po IFN-α-linker-Po IL-2高表达菌株，成功以可溶性形式表达了目的蛋白，表达量约占菌体表达总蛋白的50%以上；纯化工艺简单，可直接通过镍柱亲和层析得到大量纯化蛋白，纯化后蛋白纯度高于90%。

本研究从诱导时间、诱导温度、IPTG浓度3个方面对r Po IFN-α-linker-Po IL-2/p ET-32a/BL21重组菌的表达进行优化和分析，提高可溶性蛋白表达量。发现IPTG具有较高的诱导效率，浓度为0.2mmol/L时即可达到较好的诱导效果，在25℃诱导时，以可溶性形式表达的蛋白量要高于在30和37℃诱导的蛋白量，表明低温可降低蛋白表达速度，增加蛋白的正确折叠，在一定程度上有利于蛋白的可溶表达，与Ma等(2013)和Kim等(2013)的研究结果一致。 

表1 r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒增殖活性检测 

采用ELISA方法、MTS法分别检测r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白特异性免疫反应的活性及促PBLC增殖活性，证明r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白具有与抗猪α干扰素、猪白介素2单抗发生特异性免疫反应的生物学活性、且能显著促PBLC增殖，为r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在猪体内的活性研究提供了基础。

测定干扰素在细胞上抑制VSV增殖的活性是评价干扰素效价的金标准，目前我国唯一上市的猪白细胞α干扰素效价测定方法中选用的是WISH细胞和VSV。本研究为选取适宜r Po IFN-α-linkerPo IL-2蛋白活性效价测定的细胞系，比较了r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白分别在WISH和PK-15上对VSA增殖的抑制作用，结果表明，r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在WISH细胞上抑制VSV的活性效价显著高于其在PK-15细胞，因此VSV/WISH病毒/细胞体系作为r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白效价评价体系。

本研究测定了r Po IFN-α-linker-Po IL-2可溶性蛋白、包涵体蛋白及商品化猪α干扰素在不同细胞系上抑制不同病毒的增殖活性。结果显示，r Po IFN-α-linker-Po IL-2可溶性蛋白在PK-15细胞上抑制SVA的活性效价显著高于包涵体蛋白及商品化猪α干扰素；r Po IFN-α-linker-Po IL-2可溶性蛋白在WISH细胞上抑制VSV的活性效价显著高于包涵体蛋白及商品化猪α干扰素；r Po IFN-α-linkerPo IL-2可溶性蛋白在Vero上抑制PEDV增殖的活性显著高于本研究的包涵体纯化蛋白及商品化猪α干扰素；为进一步研究r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白在猪体内预防治疗PEDV、SVA等重要动物疫病提供了基础资料。

4、结论

本研究利用稀有密码子的偏好性及镍铬纯化柱对Po IFN-α-linker-Po IL-2嵌合基因进行了可溶性改造、可溶性表达和蛋白的纯化；纯化后的r Po IFN-α-linker-Po IL-2可溶性蛋白不仅具有促进猪外周血T淋巴细胞增殖活性和特异性免疫反应活性，并且对PRV、SVA、PEDV等病毒具有显著的抑制作用；为下一步开展r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白体内活性研究及研制以r Po IFN-α-linker-Po IL-2蛋白为主要成分的抗病毒和免疫增强药物提供了基础材料。

基金资助:河南省重点研发专项(231111111300);河南省重大科技专项(221100110600);河南省现代农业产业技术体系(HARS-22-12-T);河南省科技攻关项目(232102110089);

文章来源:冯桂丹,闫若潜,马震原等.重组猪α干扰素/白细胞介素-2的可溶性表达及体外活性研究[J].农业生物技术学报,2024,32(03):595-604.