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利用细胞代谢组学探讨Nrf3在胃癌细胞增殖迁移中的作用及机制

2024-03-08 18 上传者：管理员

摘要：目的:探究核因子红系2-样3(NF-E2-related factor 3 or NFE2L3,Nrf3)对胃癌细胞代谢、增殖及迁移能力的影响及作用机制。方法:通过生物信息学分析Nrf3在胃癌组织中的表达；慢病毒构建基因沉默Nrf3的胃癌细胞株；基于人细胞UHPLC-OE-MS非靶标代谢组学技术，对胃癌细胞(AGS)及Nrf3敲降细胞进行代谢组学分析；利用RT-qPCR及Western blot实验检测敲降Nrf3对胆碱代谢关键酶的影响；采用CCK-8及划痕实验检测敲降Nrf3对胃癌细胞增殖、迁移的影响；通过外源性给予胆碱类似物氯化胆碱后观察胃癌细胞增殖、迁移能力的改变。结果:生物信息学分析发现胃癌组织中Nrf3表达高于癌旁组织；敲降Nrf3显著改变了胃癌细胞的代谢特征，鉴定到57个对分类有显著贡献的差异代谢物，其中32个代谢物在敲降Nrf3的胃癌细胞中减少，25个代谢物增加；Nrf3敲降导致胃癌细胞8条通路改变(P<0.05),其中胆碱、精氨酸和脯氨酸代谢改变最为明显(P<0.01);RT-qPCR及Western blot实验结果显示，敲降Nrf3后影响了胆碱代谢关键酶PLA2、LYPLA1、GPCPD1、CHK的表达，其中GPCPD1改变最为显著；CCK-8、划痕实验结果揭示了敲降Nrf3抑制胃癌细胞的增殖及迁移；外源性给予胆碱类似物氯化胆碱能部分逆转敲降Nrf3导致的胃癌细胞增殖、迁移能力的减弱。结论:敲降Nrf3抑制胃癌细胞增殖和迁移，其机制可能与胆碱代谢重编程有关。

关键词：
Nrf3
增殖迁移
胃癌
胆碱代谢
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胃癌(gastric cancer, GC)是全球高发病率和高死亡率的消化系统恶性肿瘤之一[1]。在我国，胃癌发病人数和死亡人数均排在第三位[2],其中死亡人数约占全球的50%。胃癌早期缺乏典型的症状和体征，确诊困难，大多数患者确诊时已进展为晚期[3]。近年来，胃癌的诊断技术及治疗手段取得了一定的进展，然而胃癌患者的预后状况并没有得到显著改善。因此，进一步研究胃癌的发病机制，发现新的治疗靶点和新型生物标志物对于胃癌的治疗显得尤为迫切。

核因子红系2-样3(NF-E2-related factor 3 or NFE2L3,Nrf3)是帽 'n' 领(CNC)家族的一员[4],编码 694 个氨基酸，包括 NHB1、NHB2、PEST、NST、Neh6L、CNC-bZIP、Neh3L等结构域[5,6]。Nrf3定位于内质网和核膜[7],被诱导激活后进入细胞核[8],通过与 sMaf 蛋白形成二聚体识别 DNA 上的抗氧化或亲电反应元件(ARE/EpRE)从而激活下游基因转录[4]。现有的文献研究表明，Nrf3与肿瘤的发展密切相关，且在大多数肿瘤组织中呈现高表达[9]。在结直肠癌中，NFE2L3 作为双同源盒因子 4(double homeobox 4,DUX4)的抑制因子调节 CDK1 的表达进而影响细胞周期，同时证实 NF-κB 信号通路抑制剂可明显降低 Nrf3表达水平[10]。此外，Nrf3通过20S 蛋白酶体降解 p53[11]或诱导细胞周期调节因子UHMK1的基因表达[8]等不同途径，发挥癌症驱动基因样功能[4],赋予细胞选择性生长优势，广泛参与包括胃癌在内的多种癌症[12,13,14]的发生与发展。

本研究前期发现Nrf3影响了胃癌细胞增殖及迁移，然而代谢水平Nrf3是通过何种途径调控胃癌细胞增殖和迁移的，尚不明确。因此，本实验以胃癌细胞(AGS)及Nrf3敲除细胞(AGS/shNrf3)为研究对象，基于UHPLC-OE-MS非靶标代谢组学研究敲降Nrf3胃癌细胞的代谢特征变化，结合生物信息学及功能验证阐释Nrf3在胃癌细胞中的代谢调节作用。

1、材料与方法

1.1 主要材料

胃癌细胞株AGS、HGC27 购自中科院。RPMI-1640培养基购自美国 Gibco 公司，胎牛血清购自BI公司，Trizol(总RNA抽提试剂)、Western及IP细胞裂解液购自上海碧云天生物技术公司，蛋白质定量试剂盒、Qucnt cDNA第一链合成试剂盒以及SuperReal荧光定量预混试剂彩色版(SYBR Green)购于TIANGEN公司，GAPDH Antibody购于Abways公司，NFE2L3 Antibody 购于abcepta, GPCPD1 Rabbit pAb购于正能生物，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗购于上海碧云天生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生信分析数据处理

通过TCGA和GEO数据库(GSE84692)下载胃癌相关数据(TCGA数据库肿瘤组织n=375例，正常组织n=32例；GEO数据库肿瘤组织n=205例，正常组织n=12例),将文件进行基因 ID 转换，通过R软件将正常组织和肿瘤组织的Nrf3表达情况可视化，制作成柱状散点图。

1.2.2 构建基因沉默Nrf3的胃癌细胞株

胃癌细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中。使用Nrf3-shRNA慢病毒(购自cyagen生物) 构建Nrf3敲降的胃癌细胞株，敲降细胞株分别命名为AGS shNrf3#1、AGS shNrf3#2,HGC27 shNrf3#1、HGC27 shNrf3#2。将细胞消化、离心、重悬于6孔板内，加入慢病毒和阳离子聚合物polybrene, 混匀后放入孵箱培养48 h, 用嘌呤霉素盐酸盐溶液筛选稳定转染细胞，提取蛋白质和RNA验证转染结果。敲降Nrf3慢病毒干扰序列见表1。

表1 序列

1.2.3 样品制备及代谢物提取

将AGS/shNrf3和AGS细胞培养到一定数量后，一组用于细胞计数，另一组用于实验。两组均用胰酶消化收集细胞悬液，确保实验组各样本的细胞数相同且不少于1×107/mL。得到样品细胞沉淀后，液氮速冻，转移至-80 ℃保存。按以下方法提取代谢物：细胞沉淀加入1 mL提取液[甲醇∶水=3∶1(V/V),含同位素标记内标混合物],放入液氮罐中冷冻1 min, 取出后解冻，涡旋混匀30 s, 重复以上步骤2至3次，冰水浴超声10 min, -40 ℃静置1 h, 将样品4 ℃、12 000 r/min(离心力13 800×g, 半径8.6 cm)离心15 min。上清经0.22 μm微孔滤膜过滤，质谱检测。取等体积待检样本，充分混合作为质控(quality control, QC)样本。

1.2.4 RT-qPCR实验

向样品细胞中加入Trizol(总RNA抽提试剂)提取总RNA,按照说明书步骤将RNA逆转录为cDNA,进行荧光实时定量 PCR反应。引物序列见表2。

1.2.5 Western blot实验

向各组样本细胞沉淀中加入细胞裂解液(按Western及IP细胞裂解液∶PMSF=100∶1的比例配置)提取总蛋白后进行蛋白定量，每组蛋白样品都取相同的质量进行SDS-PAGE电泳，利用湿转将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉液室温封闭1 h, 一抗Nrf3(1∶1 000)、GPCPD1(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000),4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗(1∶8 000)室温孵育1 h, TBST洗膜，显影后分析处理图片。

1.2.6 CCK-8实验

在96孔板内接种一定数量的细胞(AGS、HGC27分别为3 000个/孔和4 000个/孔),放孵箱培养至贴壁(即0 h),再继续培养24 h、48 h, 分别加入含10%CCK-8试剂的培养基孵育一定时间后测450 nm处的OD值。

表2 RT-qPCR中所用引物序列

1.2.7 划痕实验

将细胞铺板于6孔板，待各孔细胞长满后，用200 μL枪头沿直尺垂直于孔底划粗细均匀的直线，PBS清洗，加入无血清培养基，分别培养0 h、48 h拍照，分析处理图片。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0进行统计学分析，实验结果以平均数±标准差表示。两组均数比较使用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 Nrf3在胃癌组织中高表达

TCGA 和GEO(GSE84692)数据库分析发现，Nrf3在胃癌组织中mRNA水平的表达高于正常组织(P<0.05,见图1)。

2.2 Nrf3基因沉默细胞株的构建

慢病毒构建Nrf3敲降的胃癌细胞株后，采用RT-qPCR和Western blot实验验证AGS 和HGC27细胞中Nrf3的mRNA和蛋白水平。结果显示：感染慢病毒后Nrf3的mRNA(图2 A-B)和蛋白(图2C-D)表达量均降低，表明Nrf3敲降的胃癌细胞株构建成功，可用于后续实验操作。

图1 Nrf3在胃癌及正常组织中的表达情况

图2 敲降Nrf3后AGS和HGC27细胞Nrf3的mRNA和蛋白相对表达量变化

2.3 敲降Nrf3对胃癌细胞AGS代谢的影响

2.3.1 差异代谢物筛选

根据VIP值、P值和FC值鉴定差异代谢物57个，其中正离子33个，负离子24个(表3)。采用热图显示差异代谢物的变化水平，其中32个代谢物在AGS /shNrf3细胞中显著降低，25个代谢物显著增加(图3A-B);代表性化合物的化学结构为甘油磷酸胆碱(Glycerophosphocholine)和溶血磷脂酰胆碱[LysoPC(20∶4)](图3C-D)。

表3 AGS/shNrf3细胞显著变化的代谢物

图3 AGS与AGS/shNrf3细胞差异代谢产物的分析与鉴定

2.3.2 代谢通路富集分析

将差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0数据库作通路分析，剔除P>0.05的代谢通路，甘油磷酸脂代谢具有较高的通路影响值(PIV=0.264)和较小的P值(P=0.001 3),精氨酸和脯氨酸代谢的通路影响值为0.255,A-亚麻酸代谢的通路影响值为0.333、P值为0.013 6(图4A,表4)。富集结果显示，AGS/shNrf3细胞中胆碱代谢通路代谢物，包括甘油磷酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、脂肪酸的水平降低(P<0.05,图4B)。进行差异代谢物-调控基因网络分析发现甘油磷酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱及脂肪酸代谢紊乱，这些通路均与胆碱代谢信号通路密切相关(图4C)。

图4 AGS与AGS/shNrf3细胞差异代谢产物通路分析

表4 AGS/shNrf3细胞显著变化的代谢通路

2.4 胆碱代谢关键酶的检测

根据代谢组学得到的两组间胞内胆碱代谢、精氨酸和脯氨酸代谢及Α-亚麻酸代谢肌酸代谢途径中的代谢物差异较为显著，进一步用RT-qPCR检验基因层面上胆碱代谢关键限速酶的变化。结果表明：相较于正常组，敲降Nrf3组在胆碱代谢途径中，PLA2、CHK、GPCPD1表达显著性降低，而LYPLA1表达升高，其中GPCPD1改变最为明显(图5A)。Western blot 实验进一步证明：敲降Nrf3后，GPCPD1显著下调(图5B-C)。

图5 胆碱代谢关键酶的检测

2.5 敲降Nrf3对胃癌细胞AGS和 HGC27增殖、迁移的影响

采用CCK-8实验检测敲降Nrf3对胃癌细胞增殖能力的影响，结果显示：敲降Nrf3抑制胃癌细胞AGS和HGC27的增殖(图6A-B)。采用 Transwell迁移实验检测敲降Nrf3对胃癌细胞AGS(图6C-D)和HCG27(图6E-F)迁移能力的影响，结果显示：敲降Nrf3抑制胃癌细胞的迁移。

2.6 外源性给予胆碱类似物氯化胆碱部分逆转Nrf3敲降导致的胃癌细胞AGS增殖、迁移的抑制

CCK-8实验检测外源性给予胆碱类似物氯化胆碱后AGS的增殖情况，结果显示：外源性给予胆碱类似物氯化胆碱能部分逆转Nrf3敲降导致的胃癌细胞的增殖抑制(图7A)。

划痕实验(图7B-C)检测外源性给予胆碱类似物氯化胆碱后AGS细胞的迁移情况，结果表明：外源性给予胆碱类似物氯化胆碱能促进胃癌细胞的迁移。

3、讨论

本研究首先通过生物信息学分析发现Nrf3在胃癌组织中高表达，然后通过构建基因敲降Nrf3的胃癌细胞株进行代谢组测序。结果发现：敲降Nrf3导致胃癌细胞代谢产物显著改变，共鉴定差异代谢物57个，其中32个代谢物在AGS/shNrf3细胞中显著降低，25个代谢物显著增加。将差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0数据库作通路分析，发现甘油磷酸脂代谢具有较高的通路影响值(PIV=0.264)和较小的P值(P=0.001 3)。进一步的研究表明：与亲本株相比，AGS/shNrf3细胞中胆碱代谢通路代谢物，包括甘油磷酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、脂肪酸的水平降低(P<0.05)。进行差异代谢物-调控基因网络分析发现甘油磷酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱及脂肪酸代谢紊乱，这些通路均与胆碱代谢信号通路密切相关。胆碱(Cho)主要以磷脂酰胆碱(又称卵磷脂)的形式存在，是构成细胞膜的重要成分，参与调节细胞物质转运过程、蛋白质功能和信号转导，影响膜蛋白的功能和代谢[15]。胆碱是一种必需的营养素，通过胆碱激酶(choline kinase, CHK)磷酸化为磷酸胆碱(PCho),再通过肯尼迪途径(磷脂酰胆碱合成代谢途径)结合到细胞膜中[16]。

图6 敲降Nrf3对胃癌细胞AGS和HGC27增殖和迁移能力的影响

图7 外源性给予胆碱类似物氯化胆碱部分逆转了Nrf3敲降导致的胃癌细胞AGS增殖和迁移抑制

代谢重编程是癌症显著特征之一[17,18]。活化的胆碱代谢已成为癌症的标志，前期已有研究报道乳腺癌[19]、卵巢癌和前列腺癌[20]等癌症的胆碱代谢均发生了改变，其特征是磷酸胆碱(phosphorylcholine, PC)、甘油磷酸胆碱(glycerylphosphoryl choline, GPC)和总含胆碱化合物(tCho)水平升高[21]。在本研究中，我们发现敲降Nrf3显著降低了胆碱相关的代谢产物后，进一步检测了胆碱的关键酶的表达，结果表明 PLA2、CHK、GPCPD1表达显著性降低，而LYPLA1升高，其中GPCPD1的改变最为明显。甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(glycerophosphocholine phosphodiesterase, GPCPD1)是甘油磷酸二酯酶(glycerophosphodiesterrase, GDE)蛋白家族中与癌症相关的第一个成员，定位于细胞质，不包含跨膜结构域[22],能将甘油磷酸胆碱切割为胆碱和甘油-3-磷酸(G3P),G3P在信号传导中起核心作用，GPCPD1将胆碱代谢与信号活性联系起来，促进肿瘤的恶性表型[20]。已经有报道表明，GPCPD1通过PKCα信号通路影响癌症细胞的迁移、黏附和扩散，与癌症的增殖和迁移密切相关[23]。在本研究中我们发现敲降Nrf3抑制了胃癌细胞的增殖及迁移，同时导致胃癌细胞胆碱代谢明显改变，且Nrf3敲降的胃癌细胞株其GPCPD1表达水平降低，提示Nrf3对胃癌细胞增殖、迁移的影响可能与代谢重编程调控GPCPD1的表达有关。外源性给予胃癌细胞胆碱类似物氯化胆碱发现能够部分逆转Nrf3敲降导致的胃癌细胞增殖、迁移抑制。

综上所述，Nrf3可能通过影响胃癌细胞的胆碱代谢，从而促进胃癌细胞增殖、迁移，这为胃癌的治疗提供了一个新的策略。

参考文献:

[18]来嘉伟,程永毅,周建成.代谢组学和肾癌中代谢重编程的研究进展[J].现代肿瘤医学,2022,30(17):3217-3220.

基金资助:四川省南充市科技局项目(编号:20SXCXTD004);川北医学院重点培育项目(编号:CBY22-ZDA-02);

文章来源:陈梦未,陈雅慧,候维等.利用细胞代谢组学探讨Nrf3在胃癌细胞增殖､迁移中的作用及机制[J].现代肿瘤医学,2024,32(07):1186-1193.