胃癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤，现阶段随着医疗技术的进步胃癌临床治疗方法具有多样化且患者生存率得到了明显改善。但是流行病数据显示胃癌患者复发率较高是导致患者死亡的主要原因，因此减少胃癌患者复发及转移对于提高预后有重要意义[1]。目前，随着分子生物学及基因学的快速发展，人们对胃癌有了更深入的了解及认识，可以为临床提供更合理的治疗策略。肿瘤干细胞是肿瘤组织内一类具有干细胞特性的细胞，可以以有丝分裂的方式进行不对称分离，促使瘤体扩大[2]。胃癌肿瘤干细胞2009年被首次提取，并证实是以CD44+表达特征的体外培养出现球星集落的细胞，小鼠皮下种植可成瘤。CD44+及CD133均为胃癌干细胞活性标志物，日本一项实验证实在胃癌大鼠中增加CD44蛋白可增加抑癌基因p53的失活，是胃癌病理生理过程重要环节。王帅[3]研究表示，CD133可以通过调节细胞凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)活性而增加胃癌细胞耐药。转录因子激活增强子结合蛋白(TFAP)4在机体组织广泛表达，可与DNA结合转录后对相关因子进行调控[4]。已经证实，TFAP4在多种肿瘤组织中呈现高表达，如大肠癌、肝癌及胃癌等。文献证实，TFAP4-小干扰RNA(siRNA)可通过调节Yes相关蛋白(YAP)而抑制胃癌细胞侵袭及迁移，因此通过抑制TFAP4表达可能成为胃癌疾病的治疗靶点[5]。中医药在肿瘤疾病的治疗中优势巨大，四君子汤是由多味中草药组成的古方剂，主治脾胃气虚，该方已经成为治疗脾胃气虚的基础方[6]。有报道证实，四君子汤可以诱导胃癌细胞凋亡，但是对胃癌干细胞的影响还无研究，本文以此作为创新点，观察四君子汤对胃癌干细胞标志物活性及TFAP4水平的影响，为胃癌治疗提供药物参考依据。

1、材料与方法

1.1 细胞来源及培养

SGC-7901胃癌细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司。SGC-7901细胞置于显微镜下观察有无污染，放入37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，24 h后弃去培养体后加入含有1%双抗的10%胎牛血清中培养，培养条件同上。显微镜下观察SGC-7901细胞生长至80%～90%时进行传代，75%乙醇消毒，弃去旧的培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，加入0.25%胰蛋白酶消化，生长至90%时终止反应，脱壁后，放入15 ml的离心管中1 000 r/min, 离心5 min后，弃去上清液放入培养基中2～3 d传代。

1.2 药物

四君子汤：人参(五加科植物人参 Panax ginseng C.A.Mey.的干燥成熟根，产地辽宁)、白术(菊科草本植物白术 Atractylodes macrocephala Koidz.的成熟干燥根茎，产地江苏)、茯苓[多孔菌科茯苓 Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核，产地湖南]、炙甘草(蝶形花亚科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，产地新疆)按照2∶2∶2∶1比例制成，成分由医院药学部主任鉴定。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM培养基、DMEM/F12培养基购自中国上海微科生物；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、二甲基亚砜(DMSO)试剂均购自北京索莱宝科技有限公司；鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、兔抗人Bax、Bcl-2单克隆抗体、兔抗人TFAP4单克隆抗体均购自中国上海圻明生物科技；山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G及山羊抗小鼠IgG购自中国武汉纯度生物科技；仪器：电子天平购自中国上海众渊实业；高温灭菌锅购自中国济南卓隆生物科技；TDZ4-WS 低速台式离心机购自中国湖南湘瑞生物；倒置显微镜购自中国上海豫光仪器；凝胶成像系统及Western印迹电泳系统均购自中国背景赛百奥科技。

1.4 SGC-7901干细胞培养

取对数生长的SGC-7901细胞经胰蛋白酶消化后制备出单细胞悬液，PBS冲洗后，将2 000个细胞接种6孔板中，添加含有人类细胞抗原B27、无血清添加剂(N-2)、表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基每孔约2 ml, 在37 ℃5% CO2中培养。培养3 d观察细胞呈现球形生长，加入新鲜培养基以维持细胞生长。

1.5 含药血清的制备

20只SD成年雄性大鼠，体质量240～260 g, 鼠龄4～5 w, 在广东省医学实验动物中心购买。动物许可证号：SYXK(粤)2017-0026,在通风且干净的环境中对大鼠进行饲养，5只大鼠1个笼子，温度23 ℃左右，湿度50%左右，黑夜白昼交替循环，自由进食标准颗粒饲料，饮干净饮用水。所有实验动物于开始实验前，适应环境饲养1 w。20只大鼠随机分为空白组及含药血清组，每组10只，根据人与大鼠体质量换算各组给药量[6],含药血清组灌胃0.01 ml/(g·d)的四君子汤，空白组给予0.9%的生理盐水灌胃。单日喂药2次，持续喂药1 w后，末次给药后无菌条件下心脏取血，分离血清，用0.22 μm微孔滤膜除菌后分装于1.5 ml离心管内，逐级冻存，在-80 ℃条件下保存备用。

1.6 SGC-7901干细胞形态观察及集落形成能力

将SGC-7901干细胞置于倒置纤维镜下观察形态。集落形成能力：SGC-7901干细胞采用移液器吹打细胞球成单个细胞，收集单细胞悬液后，接种100 mm的培养皿中，贴壁消化SGC-7901也接种到100 mm培养皿中，采用培养基培养2 d后，PBS冲洗，采用4%的多聚甲醛固定紫染色10 min, PBS冲洗，至细胞集落清晰可见，拍照记录，任意取3个视野计数大于50个细胞的集落数，进行统计分析。

1.7 分组及处理

SGC-7901干细胞分为A组(对照组，SGC-7901干细胞在150 μl 10%大鼠空白血清培养基培养)、B组(四君子汤低剂量组，SGC-7901干细胞在75 μl 2.5% 大鼠四君子汤含药血清中培养)、C组(四君子汤中剂量组，SGC-7901干细胞在75 μl 5% 大鼠四君子汤含药血清中培养)、D组(四君子汤高剂量组，SGC-7901干细胞在75 μl 7.5% 大鼠四君子汤含药血清中培养)及E组(5-氟尿嘧啶组，SGC-7901干细胞+含有1 mg/ml的5-氟尿嘧啶培养基中培养)。

1.8 CCK-8检测各组细胞增殖率

6孔板中每孔均加入150 μl SGC-7901干细胞悬液，细胞数目为5×103个/孔，每组设置6孔，加入CCK-8试剂(5 g/L),每孔20 μl, 遮光条件下加入200 μl DMSO溶液，轻微摇晃15 min后促使充分溶解后，在24、48、72及96 h时在波长490 nm检测吸光度(OD值)。

1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡

将0.25%蛋白酶消化的SGC-7901干细胞，接种到无牛血清培养基过夜，24 h后收集细胞，每组选择3个样本，PBS洗涤1次，100 μl接种于5 ml流式试管中，5 μl的异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白(Annexin)Ⅴ与5 μl碘化丙啶(PI)混合后染色，无光条件下，孵育15 min后注入400 μl 结合缓冲盐混匀，予以洗涤，次数3次，后采用流式细胞仪分析细胞凋亡程度。

1.10 免疫印迹检测SGC-7901干细胞标志物CD44、CD133、Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白水平

SGC-7901干细胞移入6孔板中，细胞浓度为2.5×104个ml, PBS冲洗，加入150 μl放射免疫沉淀(RIPA)的裂解液，12 000 r/min离心15 min后，进行电泳实验。聚偏氟乙烯(PVDF)膜Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)浸泡10 min, 反复PBS冲洗，5 min/次，加入CD44(1∶500)、CD133(1∶500)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)及TFAP4(1∶500)1抗和内参GAPDH抗体(1∶1 000),TBS冲洗3次后，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔(1∶5 000),杂交冲洗。后将膜浸入电化学发光(ECL)工作液，随后进行检测，获取图像。

1.11 统计学分析

采用GraphPad Prism8软件进行方差分析、Bonferroni法。

2、结果

2.1 SGC-7901干细胞形态改变

SGC-7901干细胞随着生长周期的延长，球体逐渐增大，3 d时体积较小结构松散，4 d时细胞呈现椭圆形生长，5 d时细胞结构更致密，形态更加接近球形，且一个球体所包含细胞数目可达到数十个，见图1。

2.2 SGC-7901细胞及SGC-7901干细胞集落形成能力

SGC-7901及SGC-7901干细胞的细胞集落分别为(12.25±2.50)、(34.60±3.14)个，组间比较存在显著差异(t=13.640,P<0.001),见图2。

2.3 四君子汤对SGC-7901干细胞活性的影响

CCK-8结果显示：与A组相比，B组、C组、D组及E组24、48、72及96 h时SGC-7901干细胞活性均显著降低(均P<0.05);与B组相比，C、D、E组上述时间细胞活性明显降低(P<0.05);与C组相比，D、E组上述时间细胞活性明显降低(P<0.05),D组和E组比较无统计学意义(P>0.05),见表1。

图1 SGC-7901干细胞形态(免疫荧光染色，×40)   

图2 SGC-7901细胞及SGC-7901 干细胞集落形成能力比较(结晶紫染色)  

2.4 四君子汤对SGC-7901干细胞凋亡率的影响

A组、B组、C组、D组及E组SGC-7901干细胞凋亡率分别为(7.08±0.50)%、(13.70±1.51)%、(19.44±2.20)%、(27.03±2.69)%及(28.10±2.55)%,组间比较存在显著差异(F=112.900,P<0.001),进一步比较，与A组比较，B组、C组、D组及E组凋亡率均显著升高(P<0.05),与B组比较，C、D、E组显著升高(P<0.05);与C组比较，D、E组显著升高(P<0.05),D组和E组比较无统计学意义(P>0.05),见图3。

表1 各组不同时间SGC-7901干细胞活性及干细胞标志物活性比较

图3 各组SGC-7901干细胞凋亡率   

2.5 四君子汤对SGC-7901干细胞标志物CD44及CD133活性的影响

与A组比较，B组、C组、D组及E组CD44及CD133蛋白表达均显著降低(P<0.05);与B组相比，C、D、E组CD44及CD133显著降低(P<0.05);与C组相比，D、E组CD44及CD133显著降低(P<0.05),D组与E组比较无统计学意义(P>0.05),见表1、图4。

2.6 各组SGC-7901干细胞Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白比较

与A组比较，B组、C组、D组及E组Bax增加，Bcl-2及TFAP4降低，组间比较存在显著差异(P<0.05);与B组比较，C、D、E组Bax显著增加，Bcl-2及TFAP4显著降低(P<0.05);与C组相比，D、E组Bax显著增加，Bcl-2及TFAP4显著降低(P<0.05),D组与E组比较无统计学意义(P>0.05),见表2、图5。

图4 各组SGC-7901干细胞标志物CD44及 CD133蛋白表达  

表2 各组SGC-7901干细胞Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白水平比较

图5 各组SGC-7901干细胞Bax、Bcl-2及TFAP4蛋白   

3、讨论

胃癌干细胞是胃癌组织中存在数量极少的肿瘤干细胞，自我更新能力强可以无限增殖且存在多向分化的可能。研究发现，在胃癌细胞中加入EGF及bFGF后可以增加胃癌细胞成球能力，接种到小鼠皮下几个月后可成瘤，与普通胃癌相比具有更强的成瘤能力[7]。有学者认为，肿瘤干细胞可能是胃癌患者复发及转移的根源，因此如何杀伤胃癌干细胞是临床治疗关键[8]。本文证实，四君子汤对胃癌干细胞具有抑制作用，研究机制与调控TFAP4相关。

胃癌SGC-7901干细胞随着生长周期的延长，初期体积较小结构松散，随着时间延长细胞呈现椭圆形生长，细胞结构致密，形态更加接近球形。与SGC-7901细胞相比，SGC-7901干细胞在无血清条件下悬浮培养后，集落形成能力较强，可形成瘤体，而SGC-7901细胞却不能。本文结果说明，四君子汤具有抗胃癌干细胞活性作用。

肿瘤干细胞学说认为，肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞相比具有增殖速度快的特点，且其特点可增加对抗化疗药物敏感性导致临床疗效降低。近些年，研究发现炒白术、党参及四君子汤等健脾扶正药物可以发挥抗胃癌活性的作用，促使胃癌细胞核固缩而加快凋亡[9]。中医将胃癌归属为“胃脘痛”的范畴，病因病机与机体为内虚外感风邪，加之情志不畅饮食损伤导致阴阳失调，脏腑功能失常而导致一系列病理改变，临床应采用扶正祛邪、补脾益气为主，辅以祛湿化瘀、消痈散结等辨证论治[10]。四君子最早记载于《太平惠民和剂局方》,由人参、白术、茯苓及甘草组成具有益气健脾及扶正固本的作用，可针对脾胃虚弱病症有较好的治疗作用。人参是临床广泛应用的抗肿瘤药物，人参中有效活性成分包含人参多糖、人参皂苷等均具有抗肿瘤作用。在骨肉瘤干细胞中人参皂苷有显著抑制增殖作用。白术为菊科苍术属植白术，具有除燥利湿及健脾补气的作用。李小芳等[11]研究认为白术可通过多种途径发挥抗肿瘤作用，主要与介导凋亡信号通路而减少胃癌肿瘤细胞增殖，加快凋亡有关。茯苓归脾、肾经，具有健脾、利尿渗湿及宁心之功效。茯苓抗肿瘤成分主要为茯苓多糖及茯苓三萜类，并已经证实茯苓多糖可以抑制胃癌小鼠瘤体体积。CD44及CD133是近些年胃癌干细胞最常见的标志物[12],在胃癌干细胞均为有膜结构的受体，可以直接表达于肿瘤细胞膜上，可以利用这一特点直接进行靶点治疗[13]。CD44及CD133表达具有非特异性，在胃癌、卵巢癌、乳腺癌等中呈现高表达，认为两者表达的下游相关信号通路可能对多种恶性肿瘤生长机制存在研究价值[14]。本文研究发现，四君子汤可以对胃癌干细胞标志物CD44及CD133具有抑制作用。四君子汤中人参为君药，益气、健脾及养胃功效。白术为臣药可发挥健脾燥湿，益气助运的作用。茯苓与白术相互匹配健脾祛湿之功更显著。炙甘草调和诸药，共同发挥补益气血、益气健脾的作用。以往研究证实，四君子汤可以加快乳腺癌干细胞凋亡，机制与四君子汤可以抑制程序性死亡受体配体(PD)-L1表达相关[15]。

本文结果说明，四君子汤具有调控细胞凋亡信号而加快肿瘤细胞凋亡的作用。Bax/Bcl-2是目前研究最广泛的细胞凋亡信号通过，两者可通过形成同源或异源二聚体进而调节细胞凋亡[16]。在胃癌干细胞中Bax促凋亡因子表达降低，Bcl-2抗凋亡因子表达激活而加快肿瘤发生发展[17]。TFAP4是近些年发现的新型重要转录因子，可通过与原癌基因c-MYC 蛋白结合后抑制抑癌基因p21活性而参与胃癌发展，TFAP4高表达的胃癌患者预后更差[18]。张悦等[19]研究表示，TFAP4可加快胃癌细胞侵袭及迁移，而当沉默TFAP4后可降低胃癌细胞间质转化，这与调控 YAP信号相关。刘瑞[20]实验证实，四君子汤对胃癌细胞中细胞凋亡基因具有影响，表现在随着四君子汤浓度的增加Bax增加Bcl-2降低，说明可以通过调控该信号通路而抑制癌细胞增殖。本文推测四君子汤可能是通过抑制TFAP4蛋白表达而调节Bax/Bcl-2信号的，认为与四君子汤可以抑制胃癌干细胞活性而降低成瘤能力相关，但是具体研究机制还不清楚，需要进一步研究证实。

本文存在一定不足之处，关于四君子汤对TFAP4抑制机制还需要进一步证实，今后需要加强实验内容及单位合作，完善其作用机制，为临床研究提供实践基础。

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