骨发育在青少年时期身体生长发育过程中占有着十分重要的地位[1]。骨发育不仅与遗传、年龄、性别和激素水平等机体内在因素有关，也与营养、运动等重要的外部环境因素密切相关[2]。青少年时期的骨发育状况不仅直接关系到成年时期骨的质量，而且将影响到中老年时期的骨健康及生活质量，甚至会造成骨量丢失，引起骨质疏松症状的发生[3]。一旦患病，易在生活中引发椎体压缩性骨折，甚至因咳嗽、轻微碰撞引起骨折，继而出现疼痛、畸形、活动受限等各种骨折的临床症状体征，即会给患者的生活质量带来严重影响，还会使患者的家庭承受巨大负担。目前有关运动对骨代谢影响的研究以成年大鼠的实验性研究居多[4]，与成年大鼠相比，在骨生长的关键敏感期研究运动对生长期大鼠骨细胞代谢水平的影响，可以更好地探讨其对青少年骨发育的作用。因此，作者以生长期大鼠为实验对象，探讨不同强度耐力运动对骨细胞代谢水平的影响，以期能丰富青少年骨健康理论，并为促进青少年骨生长提供参考方法。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验。

1.2 时间及地点

于2019年4至7月在成都体育学院运动与健康学院基础实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

雄性SD大鼠40只，SDF级，鼠龄12周，体质量(341±48)g，由四川大学华西医学院动物中心提供，许可证号：SCXK(川)2018-026。大鼠适应性喂养1周。

1.3.2 饲料

为尽量避免营养不良对干预结果的影响，此次研究选用高脂饲料喂养，高脂饲料由南京安立默科技有限公司提供，其中85.5%为普通饲料，7%为猪油，2%为胆固醇，0.5%为胆酸盐，5%为白糖。

1.4 方法

1.4.1 动物分组

将40只大鼠适应性训练1周后，按随机数字表法分组分为4组(n=10)，即对照组、低强度耐力运动组、中强度耐力运动组及高强度耐力运动组。

1.4.2 运动训练

各运动实验组所有大鼠适应性训练1周，速度为10m/min,15min/d。适应性结束后开始正式的运动训练，进行最大摄氧量测试，根据测试结果确定第一至两周的训练负荷。

各运动实验组每周进行5d训练，每天训练时间为60min；每2周进行一次最大摄氧量测试，根据测试结果调整后2周的训练负荷。自正式训练开始，按照训练方案，将训练分为热身期、中间期、主负荷期和恢复期4个阶段，时间分别为5,20,30,5min[5]。跑速在热身期和恢复期为8m/min，中间期分为2个10min，速度递增，最后在主负荷期的负荷强度为相应的最大摄氧量强度百分比负荷。小强度耐力运动组、中强度耐力运动组、大强度耐力运动组主负荷强度分别为50%,65%,80%最大摄氧量[6]。各实验组共进行12周的运动干预，具体方案见表1。对照组大鼠进行常规饲养，不参与运动干预。

表1大鼠12周训练主负荷期的跑速(m/min)

1.5 主要观察指标

1.5.1 骨密度指标检测

运动训练实验前、后采用上海佰珐科学仪器有限公司生产的小动物双能X射线骨密度分析仪，对大鼠胫骨、全身的骨密度进行检测。方法：(1)用乙醚麻醉后，使大鼠保持不动，进行检测；(2)检测完毕后，使用小动物专用分析软件画出左右股骨，计算出股骨密度、全身骨密度。

1.5.2 骨结构指标检测

运动训练实验后采用德国蔡司公司生产的电子显微镜观察，并定量分析骨小梁面积。方法和步骤：(1)采用浸有乙醚的棉球连同大鼠一起密封于玻璃容器内麻醉处死大鼠，取大鼠股骨后，剔除其肌肉和筋膜等，快速称质量；(2)称质量后，立即放入体积分数10%甲醛溶液中固定；(3)固定24h后，放入EDTA中脱钙(每2d换1次EDTA);(4)脱钙5周后，用流水冲洗股骨，沿其长轴剖开股骨，用梯度乙醇进行脱水；(5)用石蜡包埋，切片厚度为5µm;(6)电子显微镜每张切片中随机采集10个视野，采用Imageproplus软件分析计算出骨小梁面积。

1.5.3 骨代谢指标检测

运动实验结束后，抽取大鼠血清，将股骨分离。采用武汉华联科生物技术有限公司生产的大鼠ELISA试剂盒，严格按照使用说明书要求检测碱性磷酸酶(比色法)及抗酒石酸酸性磷酸酶(比色法)测量血清及骨组织中骨代谢相关酶或蛋白的变化情况。

1.5.4 最大摄氧量测试

大鼠运动训练正式开始后，每2周测试1次。参照LEANDRO等[7]的Wistar大鼠最大摄氧量测试模型，利用哥伦布气体代谢仪、跑台，采用逐渐递增负荷的方式测试。跑台坡度保持为10°斜角，起始速度为5m/min，最大速度为50m/min。第一级负荷持续时间为4m/min，此后每一级负荷持续3m/min。测试环境温度控制为(22.0±2.0)℃，相对湿度控制为(50±10)%。判定大鼠达到最大摄氧量的标准：在电刺激的情况下大鼠不能继续在跑台上持续运动，两级之间摄氧量增长率小于5%。具体测试方案见表2。

表2大鼠最大摄氧量测试方案

1.6 统计学分析

所有实验数据均采用±s表示，统计学分析采用SPSS22.0统计分析软件完成，各组之间的比较采用单因素方差分析。以P<0.05作为差异有显著性意义的标准，P<0.01作为差异有非常显著性意义的标准。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

共纳入大鼠40只，随机分为4组，全部进入结果分析，无脱失值。

2.2 不同强度耐力运动对生长期大鼠骨密度的影响

大鼠股骨密度、全身骨密度，运动训练前4组大鼠比较差异均无显著性意义(P>0.05)。运动训练后，小强度耐力运动组、中等强度耐力运动组与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)；大强度耐力运动组与小强度耐力运动组、对照组相比差异有非常显著性意义(P<0.01)；小强度耐力运动组与中强度耐力运动组相比差异无显著性意义(P>0.05)。

运动训练实验后，对照组与运动训练实验前相比差异无显著性意义(P>0.05)；而小强度耐力运动组、中强度耐力运动组与实验前相比差异有显著性意义(P<0.05)；大强度耐力运动组与实验前相比差异有非常显著性意义(P<0.01)，见表3。

表3各组大鼠骨密度比较(±s,n=10,g/cm2)

2.3 不同强度耐力运动对生长期大鼠骨结构指标的影响

关于大鼠骨小梁面积，运动训练实验后，小强度耐力运动组、中强度耐力运动组与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)；大强度耐力运动组与对照组相比差异有非常显著性意义(P<0.01)；小强度耐力运动组与中强度耐力运动组差异无显著性意义(P>0.05)；大强度耐力运动组与小强度耐力运动组、中强度耐力运动组相比差异有显著性意义(P<0.05)，见图1。

图1各组大鼠骨小梁面积比较

2.4 不同强度耐力运动对生长期大鼠骨组织指标的影响

关于大鼠股骨组织中骨钙素、碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶等指标，运动训练实验后，小强度耐力运动组、中强度耐力运动组与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)；大强度耐力运动组与对照组相比差异有非常显著性意义(P<0.01)；大强度耐力运动组与小强度耐力运动组、中强度耐力运动组相比差异有显著性意义(P<0.05)；中强度耐力运动组与小强度耐力运动组相比差异无显著性意义(P>0.05)，见表4。

表4各组大鼠股骨组织相关指标比较(±s,n=10)

表注：与对照组相比，aP<0.05,bP<0.01；与小强度耐力运动组相比，cP<0.01；与中强度耐力运动组相比，dP<0.01

2.5 不同强度耐力运动对生长期大鼠对血清指标的影响

关于大鼠血清中骨钙素、碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶等指标，运动训练实验后，小强度耐力运动组、中强度耐力运动组与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)；大强度耐力运动组与对照组相比差异有非常显著性意义(P<0.01)；大强度耐力运动组与小强度耐力运动组、中强度耐力运动组相比差异有显著性意义(P<0.05)；中强度耐力运动组与小强度耐力运动组相比差异无显著性意义(P>0.05)，见表5。

表5各组大鼠血清相关指标比较(±s,n=10)

3、讨论

青春发育期长期进行运动干预可促进骨生长和发育，保护健康已被学者证实，但相关的机制揭示、分子生物学层次的研究涉及不多。此次研究通过不同强度耐力运动对大鼠进行干预，分析大鼠骨密度、骨结构、骨组织、血清等骨细胞代谢指标的变化，为运动影响骨细胞分子机制提供理论参考，为运动促进青少年骨生长、骨健康提供实证参照。

3.1 不同组别大鼠骨密度变化情况

骨矿密度是骨矿代谢中骨的量化标准，是衡量骨骼强度的重要指标之一；当骨矿密度低于某一范围时会产生临床上所表现的骨质疏松[8]。大量研究显示，青少年处于生长发育的关键期，骨骼量、骨密度增加有利于青少年的成长和身体健康。此次实验通过不同强度耐力运动对生长期大鼠的干预，发现小强度耐力运动组、中强度耐力运动组、大强度耐力运动组运动后股骨密度、全身骨密度均显著大于对照组，其中大强度耐力运动组增幅最大，其次是中强耐力运动度和小强度耐力运动组，大强度耐力运动组增幅最大，小强度耐力运动组与中强度耐力运动之间增幅变化不大。从3个耐力运动组骨密度变化整体趋势表明，与对照组相比都有增加，只是增加的幅度不同。因此，大强度耐力运动、中强度耐力运动、小强度耐力运动均可增加全身骨密度、股骨密度，大强度耐力运动效果最佳，其次为中强度耐力运动、小强度耐力运动。上述研究结果提示一定强度的耐力运动对促进骨密度增长的效果最佳。

大鼠进行小强度耐力运动、中强度耐力运动和大强度耐力运动干预后，全身骨密度、股骨密度明显高于对照组，其机制可能与运动增加骨机械负荷、使骨骼量增加有关。有研究显示，经过4周、每周3次中等强度常氧运动干预，大鼠骨量有所升高[9]。还有研究表明，12周中等强度的跑台运动可以减少23周龄雌性成熟大鼠的骨丢失，增加皮质骨量[10]。另外，有学者认为，骨重构或者成骨相关基因的表达在超过阈值时才能被启动，进而促使成骨作用加强[11]。这些发现为不同强度耐力运动对骨细胞代谢水平机制的研究指出了方向，需要注意的是，对于全身骨密度、股骨骨密度的提高，大强度耐力运动组与小强度耐力运动组、中强度耐力运动组、对照组差异均有显著性意义，提示大强度耐力运动促进全身体液循环加快的同时，还能提升矿物质及其他相关物质的代谢水平与吸收能力，并且通过其他机制增强矿物质在骨骼中的沉积。有学者研究证实，当机械负荷低于下限时，骨量减少；当机械负荷在阈值范围内时，机体骨骼出现积极的应变，骨量会随着负荷的增加而增加[4]。负荷阈控制运动强度对骨发育产生的良好效应，可以用来促进青少年骨发育和预防中老年人骨质疏松症。此次实验中，小强度耐力运动组、中强度耐力运动组、大强度耐力运动组与对照组相比，均提升了全身骨密度、股骨骨密度，但对于全身骨密度、股骨骨密度的影响，小强度耐力运动组与中强度耐力运动组并没有呈现出显著差异，说明不同程度耐力运动干预在一定程度上都有成骨效应，但由于运动方式、运动负荷、运动时间不同而存在差异，其机制需进一步研究和探讨。

3.2 不同组别大鼠骨结构变化情况

骨密质、骨松质和骨髓是骨质的3个重要部分，其中骨密质由规则紧密排列的骨组织构成，分布在骨质外表；骨松质由很多针状或片状的骨小梁构成，骨小梁呈拱形结构排列是骨承重的重要保证[12]。骨小梁的拱形结构反映了骨的承受能力大小与骨小梁数量、面积和质量有密切关系。此次实验通过不同强度耐力运动干预后发现，生长期大鼠骨小梁的主要体现在骨小梁结构及数目的变化；对照组大鼠骨小梁数目变化不大、面积指标无明显变化。3个实验组运动干预后，大鼠的骨小梁面积指标仅有大强度耐力运动组发生了非常明显的变化，显著高于对照组；中强度耐力运动组、小强度耐力运动组骨小梁形态结构指标与对照组相比有变化，但变化并不显著，且中强度耐力运动组与小强度耐力运动组之间的变化差异无显著性意义。

骨结构承受压应力的能力极强，骨小梁的拱结构是骨处于理想的应力环境中的重要因素之一[13]，骨小梁面积与骨受外界压力密切相关。通常来讲，骨承受压力越大，骨小梁面积越大。此次研究结果表明，经过不同强度耐力运动干预后，大强度耐力运动组骨小梁明显大于小强度耐力运动组，表明大强度耐力运动对骨的刺激较大，产生了有益适应。另外，中等强度耐力运动组、小强度耐力运动组的骨小梁面积也比对照组大，说明中等强度、小强度耐力运动对骨的刺激产生了一定效果，且中等强度与小强度运动不足以引起骨的适应性变化。很多研究证实了运动对骨小梁面积指标的影响。王媛媛等[14]通过8周有氧运动干预后发现，大鼠的骨小梁数目、结构均有明显改善，成骨细胞在骨小梁表面排列趋于紧密。李寿邦等[15]研究得出了相同的结果，即单纯性的运动作用使得大鼠骨小梁数目增加，硬化蛋白间歇跑台运动对大鼠骨小梁静态参数有促进作用。JOO等[16]利用Micro-CT对耐力运动后生长期大鼠股骨三维微观结构的观察发现，经过9周运动后，运动组大鼠股骨骨小梁侵蚀面积显著低于对照组，运动能对骨吸收作用产生抑制。结合此次研究结果，发现3种不同强度耐力运动干预对骨小梁面积变化的影响并非完全相同，提示运动干预并不能完全反映骨小梁的数量、面积，而骨小梁面积大小可能存在一个运动刺激阈值，其中运动强度对骨小梁拱形结构、骨胶源纤维数量、质量及排列情况均存在影响。因此生长期青少年在骨发育、生长过程中，应通过有效强度的运动干预，使骨结构的性质和质量全面提升。

3.3 不同组别大鼠骨组织变化情况

骨组织在青少年骨生长过程中发挥重要作用。学者们的研究表明，骨组织中骨细胞的活跃性，是由骨钙素分泌量决定，其中骨细胞活跃程度与碱性磷酸酶密切相关，抗酒石酸酸性磷酸酶则反映了破骨细胞活性和骨吸收情况[17]。周延峰等[18]研究发现，被动运动可使骨形成指标骨钙素值显著升高，使抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性增加。覃荣周等[19]认为，采用运动结合电刺激干预的方式，能使骨钙素增加，抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性降低。JOHNSON等[20]研究显示，卵巢切除大鼠经跑步运动结合摄取杜仲提取物和单纯摄入杜仲提取物12周干预后，杜仲运动组大鼠碱性磷酸酶明显降低。此次研究发现3种不同强度耐力运动都能使骨组织中骨钙素、碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶等指数增加，其中大强度耐力运动组大鼠增加最多，而且小强度和中等强度耐力运动对骨钙素、碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶等指数的提升都很迅速且有效。RUBIN等[21]的研究结果为解释这一差别提供了一定的线索，运动可诱导成骨细胞、破骨细胞数量增加或活性提高，进而导致骨组织分泌能力增强。其他学者持续8周的匀速跑台运动实验亦表明，运动可以促进骨形成的碱性磷酸酶、抗酒石酸盐酸性磷酸酶增加[22]。因此，小强度、中强度、大强度耐力运动干预对增加生长期青少年骨组织中骨钙素、碱性磷酸酶分泌，减少抗酒石酸酸性磷酸酶分泌具有很好的作用。

骨形成与骨吸收之间的耦联障碍可引起骨质疏松症的发生，骨组织中骨钙量、碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶可分别作为反映新生成骨细胞活性、骨细胞活跃程度、破骨细胞活性以及骨吸收情况的重要指标。此次研究结果显示，大强度运动组大鼠骨钙素和碱性磷酸酶增加最明显，抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性降低最明显；其次分别为中强度耐力运动组、小强度耐力运动组，2组均低于大强度耐力运动组，但明显高于对照组，提示不同强度耐力运动能促进骨钙素和碱性磷酸酶分泌，降低抗酒石酸酸性磷酸酶分泌，从而提高骨转换，促进骨形成，增强骨重建。耐力运动这一干预手段可有效促进生长期青少年骨形成，使骨代谢平衡呈现良好的转变。同时，小强度耐力运动和中强度耐力运动干预后，大鼠骨组织中增加骨钙素、碱性磷酸酶分泌，减少抗酒石酸酸性磷酸酶分泌，与对照组相比差异有显著性意义，但2组间差异无显著性意义，这可能是由于小强度和中强度耐力运动干预强度产生的运动应答效应差异不显著。

3.4 不同组别大鼠血清变化情况

血清骨钙素由成骨细胞分泌，是反映新生成骨细胞活性的重要指标[23]。血清碱性磷酸酶主要由肝脏和成骨细胞合成，对于肝功能正常的机体，代偿性骨形成的增强易使血液中碱性磷酸酶升高，因此，血清碱性磷酸酶不仅是反映骨形成和骨转换常用的指标，而且也是成骨细胞活跃程度重要的生物标志物。有学者研究指出，一定强度的运动干预可使血清碱性磷酸酶升高，促进骨量的形成[24]。高丽[25]研究表明，大鼠在中等强度运动后，血清碱性磷酸酶活性明显高于安静组。赵常红等[26]实验后发现，10周被动跑步后，雌性大鼠血清碱性磷酸酶活性明显高于安静组。血清中抗酒石酸酸性磷酸酶水平是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的重要指标。马涛等[27]研究中发现，安静组大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶在绝经后有显著升高，体现了绝经后骨代谢高转换型骨吸收的特点；而运动组、运动+钙剂组大鼠的抗酒石酸酸性磷酸酶活性与安静组相比均下降，表明运动干预可明显抑制骨吸收，降低抗酒石酸酸性磷酸酶水平。此外，运动后大鼠骨钙素分泌增加、骨转换增高，与骨吸收增强后骨形成明显增加、使骨密度增加有关[28]。这些研究表明，对生长期大鼠进行耐力运动干预后，不仅可使骨钙素增加、骨转换增高，还能促进骨形成，增加骨密度。

此次研究结果显示，大鼠在不同强度耐力运动干预后，各耐力运动组血清骨钙素和血清碱性磷酸酶的增加幅度、血清抗酒石酸酸性磷酸酶降低的幅度与对照组差异均有显著性意义，其中大强度耐力运动组最大，其次为中强度耐力运动组，最后为小强度耐力运动组，但中强度耐力运动组和小强度耐力运动组无显著差异。上述研究结果表明，适宜的耐力运动强度可使血液骨钙素和血清碱性磷酸酶的分泌增加，血清抗酒石酸酸性磷酸酶的分泌降低，其内在机制是耐力运动的诱导导致成骨细胞数量增加或活性增强，促使破骨细胞吸收增加；引起血清骨钙素和碱性磷酸酶分泌增加，血清抗酒石酸酸性磷酸酶的含量降低。表明耐力运动既能使成骨细胞数量增加，还能增加破骨细胞的数量或提高活性，从而使骨转换和骨形成速度加快，机体骨重建加强。中强度耐力运动组与小强度耐力运动组相比虽无显著性差异，但中强度耐力运动组血清骨钙素和碱性磷酸酶高于小强度耐力运动组，血清抗酒石酸酸性磷酸酶低于小强度耐力运动组，说明中强度耐力运动下血清变化和骨形成的效果比小强度耐力运动好。

4、结论

(1)生长期大鼠在大强度耐力运动干预后，改善骨密度、骨结构、骨组织、血清等指标效果最佳，其次是中强度耐力运动，最后是小强度耐力运动；(2)不同强度耐力运动干预均可有效改善骨密度、骨结构、骨组织、血清等指标，在一定程度上表明了耐力运动对生长期大鼠骨生长的促进作用；(3)不同强度耐力运动干预对生长期青少年骨生长、骨健康以及预防中老年人骨质疏松症手段的选择具有一定参考价值；(4)尽管此次研究认为，运动可改善骨密度、骨结构、骨组织、血清等指标，但不同强度耐力运动对骨细胞代谢水平差异的机制研究并不全面，急待进一步研究。

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基金:国家社科基金一般项目(19BTY124),课题名称:成人慢性非特异性腰痛运动疗法的科学化及应用策略研究,项目参与人:陈泽刚.