中国医学科学院药物研究所1982年从青海化隆采集的新鲜冬虫夏草中分离得到蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)Cs-4菌株,该菌株经人工深层发酵培养得到的蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉富含多糖、苷类、氨基酸和黄酮等活性成分,具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳、抗氧化、抗抑郁、抑菌、镇痛、抗炎、保肝护肾等作用[1,2]。由Cs-4发酵虫草菌粉制成的多种中成药已获得中华人民共和国卫生部颁布的新药证书[3],例如金水宝胶囊、金水宝片等,具有补肾保肺、秘精益气的作用。目前,关于Cs-4菌粉保护肾脏方面的报道较多,抗肿瘤方面的报道较少。童秋声和黄明明[4]的研究表明,蝙蝠蛾拟青霉菌5g·kg-1(iP)使荷瘤小鼠的NK细胞活性提高,说明其可通过增强荷瘤小鼠NK细胞活性而发挥抗肿瘤效应。蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉石油醚提取物对H22肝癌细胞造模的荷瘤小鼠体内抗肿瘤作用的研究表明,灌胃剂量为800mg·kg-1时,石油醚提取物具有明显的抑瘤作用,抑瘤率达59.9%[5]。笔者研究了蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对H22造模的荷瘤小鼠的抗肿瘤作用,以期为蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉的进一步开发利用提供参考。

1、料与方法

1.1实验动物与细胞株

体质量为20～22g的SPF级雄性ICR小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司[许可证号:SCXK(辽)2015-0001]。小鼠H22肿瘤细胞株由吉林省肿瘤医院提供。

1.2药品及试剂

蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)Cs-4菌粉由江西国药有限责任公司提供(国药准字Z10890021);注射用环磷酰胺购自江苏盛迪医药有限公司(生产批号18082725);注射用氯化钠购自辽宁民康制药有限公司(生产批号A19D413B-1);75%酒精购自山东利尔康医疗科技股份有限公司;苦味酸购自西陇化工股份有限公司;甲醛购自天津永晟精细化工有限公司;二甲苯、无水乙醇、盐酸购自北京化工厂;氨水购自西陇科学股份有限公司;低熔石蜡、高熔石蜡购自上海华永石蜡有限公司;HE染色剂购自上海多烯生物科技有限公司;IL-6(白细胞介素-6,interleukin-6)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α,tumornecrosisfactor-α)、IFN-γ(干扰素-γ,interferon-γ)、VEGF(血管内皮生长因子,vascularendothelialgrowthfactor)、AST(谷草转氨酶,aspartateaminotransferase)、BUN(血尿素氮,bloodureanitrogen)酶联免疫试剂盒购自北京安迪华泰科技有限公司。

1.3主要仪器

MiniSpin型离心机(德国Eppendorf公司);DM3000型倒置显微镜、RM2015包埋机(德国LEICA公司);YD-1508R轮转时切片机(浙江金华市益迪医疗设备有限公司);YD-A生物组织摊片机(浙江金华市益迪医疗设备有限公司);粘附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司);SF060生物安全柜(无锡塞弗金属制品有限公司)。

1.4动物分组、造模及给药

所有小鼠均饲养于吉林农业大学菌物中心SPF级动物实验室。选择腹腔接种5～7d生长良好的H22肝癌小鼠,无菌抽取腹水,用生理盐水稀释成每毫升1×106个的瘤细胞悬液。取50只小鼠,每只小鼠右上肢腋部皮下接种0.2mL瘤细胞悬液,接种24h后将小鼠随机分5组,每组10只。取10只未接种腹水瘤细胞的小鼠作为空白组。空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水(给药体积为0.2mL·10g-1),阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)(给药浓度为20mg·kg-1·d-1,给药体积为0.1mL·10g-1),蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉低、中、高剂量组灌胃给药,给药剂量分别0.5、1、2g·kg-1·d-1(所有剂量按照《药理实验方法学》人体给药剂量换算得到[6],给药体积为0.2mL·10g-1),连续给药10d。

1.5小鼠生长情况、抑瘤率和脏器指数

实验过程中,观察各组小鼠每日饮食、饮水、排便、皮毛生长情况和精神状态。每日给药前及解剖前测定小鼠体质量,小鼠末次给药后,禁食不禁水24h,单侧眼球取血,颈椎脱臼处死,将小鼠解剖,取胸腺、脾脏、肝脏、肾脏,剥离肿瘤组织,并测定质量,计算抑瘤率和脏器指数。

1.6HE染色和免疫组化染色

将肿瘤组织于10%的甲醛溶液中固定24h,并进行常规脱色、包埋,切成4μm薄片,进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和免疫组化染色(VEGF、P53、BCL-2、BAX、Caspase-3)[7]。于400倍光学显微镜下观察肿瘤组织病理形态、染色强度,统计阳性细胞数。

1.7小鼠血清中IL-6、IFN-γ、VEGF、TNF-α、AST和BUN含量测定

小鼠单侧眼球取血,离心(3000g,10min),取上清液,按照试剂盒说明书的操作步骤检测各组小鼠血清中IL-6、IFN-γ、VEGF、TNF-α、AST和BUN的含量。

1.8统计学分析

实验数据采用SPSS25.0统计软件进行统计学分析,采用单因素方差分析比较各组间差异显著性。

2、结果与分析

2.1小鼠生长情况和抑瘤率

实验过程无小鼠死亡,接种肿瘤前各组小鼠觅食和饮水状态正常,接种肿瘤3～5d后,与空白组相比,模型组小鼠觅食和饮水减少,少数出现便溏及皮毛失去光泽等现象;阳性对照组小鼠出现活动倦怠、饮食减少、皮毛严重失去光泽等现象,各Cs-4菌粉给药组小鼠生活状态无明显异常、觅食饮水正常、毛发有光泽。

由图1可知,模型组小鼠肿瘤生长迅速,体积大,阳性对照组肿瘤生长缓慢,体积最小,各Cs-4菌粉给药组肿瘤体积介于模型组与阳性对照组之间(图1)。

由表1可知,阳性对照组和Cs-4菌粉中、高剂量组小鼠体质量增长与空白组无显著差异。模型组体质量增长量极显著小于空白组。与模型组相比,阳性对照组和Cs-4菌粉低、中剂量组小鼠体质量增加显著,高剂量组小鼠体质量增加极显著。Cs-4菌粉低剂量组小鼠的肿瘤质量显著小于模型组,阳性对照组和Cs-4菌粉中、高剂量组小鼠的肿瘤质量极显著小于模型组。随着Cs-4菌粉给药剂量的增加,抑瘤率逐渐增加,高剂量组的抑瘤率达到78.4%。

图1蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对H22荷瘤小鼠肿瘤大小的影响

A:模型组;B:阳性对照组;C:低剂量组;D:中剂量组;E:高剂量组

表1蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对H22荷瘤小鼠体质量和肿瘤质量的影响

1）：数据为平均值±标准误差（n=10）；*和**分别表示与空白组相比差异显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）；#和##分别表示与模型组相比差异显著（P<0.05）和极显著（P<0.01)

2.2小鼠脏器指数

由表2可知,与空白组相比,阳性对照组肝脏指数明显上升,Cs-4菌粉高剂量组肝脏指数与空白组无显著差异。阳性对照组小鼠肾脏指数极显著高于空白组和模型组,随着Cs-4菌粉给药剂量增加,肾脏指数逐渐下降,中、高剂量组肾脏指数与空白组无显著差异。与空白组相比,阳性对照组胸腺指数极显著降低,Cs-4菌粉各给药组胸腺指数与空白组无显著差异,且各CS-4菌粉给药组胸腺指数与阳性组差异极显著。随着CS-4菌粉给药剂量增加,脾脏指数逐渐降低,且CS-4菌粉高剂量组脾脏指数极显著小于阳性组。

表2蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对H22荷瘤小鼠脏器指数的影响

数据为平均值±标准误差(n=10);*和**分别表示与空白组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01);#和##分别表示与模型组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01);Δ和ΔΔ分别表示与阳性组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)

2.3荷瘤小鼠肿瘤组织病理切片观察结果

2.3.1肿瘤组织切片HE染色结果

肿瘤组织切片HE染色后观察到模型组肿瘤细胞排列密集,互相粘连,肿瘤细胞形态正常,呈椭球形(图2A)。阳性对照组肿瘤细胞不规则,扭曲变形,排列疏松,肿瘤细胞破裂,出现多处椭球形或长条形大面积空隙呈带状分布,提示细胞出现坏死消失现象(图2B)。Cs-4菌粉各给药组的肿瘤细胞出现不同程度的细胞扭曲变形、模糊不清等现象(图2C、D、E),其中高剂量组出现细胞严重变形并伴随大面积细胞坏死消融(图2E)。

图2肿瘤组织切片HE染色结果(400×)

A:模型组;B:阳性对照组;C:低剂量组;D:中剂量组;E:高剂量组;红色圈中为明显区域

2.3.2肿瘤组织切片免疫组化染色结果

由图3可知,与模型组相比,阳性对照组VEGF、P53、BCL-2抗体结合阳性细胞数量极显著减少,BAX抗体结合阳性细胞数量极显著增加,Caspase-3抗体结合阳性细胞数量显著增加;Cs-4菌粉各剂量组VEGF、P53抗体结合阳性细胞数量及中、高剂量组BCL-2抗体结合阳性细胞数量极显著减少,Cs-4菌粉高剂量组BAX抗体结合阳性细胞数量显著增加;CS-4菌粉各剂量组Capase-3抗体结合阳性细胞数量显著或极显著增加。CS-4菌粉高剂量组VEGF抗体结合阳性细胞数量,中、高剂量组BCL-2、Caspase-3抗体结合阳性细胞数量与阳性对照无显著差异;CS-4菌粉中、高剂量组P53抗体结合的阳性细胞数量显著或极显著少于阳性对照组。

图3蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对肿瘤免疫组化染色后阳性细胞数量的影响

数据为平均值±标准误差（n=3）；#和##分别表示与模型组相比差异显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）；△和△△分别表示与阳性对照组相比差异显著（P<0.05）和极显著（P<0.01)

由表3可知,VEGF、P53、BCL-2、BAX、Caspase-3抗体染色后,模型组阳性细胞显色强度均呈现强阳性。阳性对照组除P53抗体染色后显色强度为强阳性,其余抗体染色后均显示弱阳性。蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉各剂量组VEGF、BAX抗体染色后显示阳性,P53和BCL-2抗体染色后低剂量的显色强度为强阳性,中、高剂量组为阳性,Caspase-3抗体染色后,低、中剂量组显色强度为阳性,高剂量组显示弱阳性。

蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对H22荷瘤小鼠免疫组化染色结果可知,蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉可以使VEGF、BCL-2、P53蛋白表达下降,使BAX、Caspase-3蛋白表达上升,具有一定的抗肿瘤作用。

表3蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对肿瘤免疫组化染色后阳性细胞显色强度的影响

2.4小鼠血清中IL-6、IFN-γ、VEGF、TNF-α、AST和BUN的测定结果

由表4可知,与空白组相比,模型组小鼠血清中IFN-γ、AST、BUN含量明显增高,差异极显著;阳性对照组小鼠血清中IL-6、IFN-γ、AST含量极显著上升;Cs-4菌粉中、高剂量组的IL-6含量极显著上升;Cs-4菌粉各剂量组的IFN-γ含量显著或极显著上升,中、高剂量组的VEGF含量显著和极显著降低;高剂量组的TNF-α含量极显著升高;Cs-4菌粉低、中剂量组的AST含量极显著和显著上升,但高剂量组AST含量与空白组无显著差异;低剂量组的BUN显著高于空白组,但中、高剂量组的BUN与空白组无显著差异。

与模型组比较,阳性对照组小鼠血清中的IL-6、BUN含量极显著上升;Cs-4菌粉各剂量组的IL-6含量显著或极显著上升;高剂量组的IFN-γ含量显著上升;中、高剂量组的VEGF极显著降低;高剂量组的TNF-α含量极显著升高;各剂量组AST含量显著或极显著降低;中、高剂量组BUN含量显著和极显著降低。

与阳性组比较,Cs-4菌粉高剂量组VEGF含量显著减少,TNF-α含量显著升高;中、高剂量组AST含量显著和极显著降低。

表4蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉对H22荷瘤小鼠血清中IL-6、IFN-γ、VEGF、TNF-α、AST和BUN含量的影响

3、结论

蝙蝠蛾拟青霉菌使荷瘤小鼠NK细胞活性提高,具有一定的抗肿瘤效果[4]。本研究表明,蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉能够有效抑制肝癌H22细胞株移植肿瘤的生长,抑瘤率可达78.4%(高剂量组2g·kg-1·d-1)。

机体正常时各脏器与体重的比值比较恒定。受损脏器重量可以发生改变,故脏器系数也随之而改变。脏器系数增大,表示脏器充血、水肿或增生肥大等;脏器系数减小,表示脏器萎缩及其他退行性改变[8]。本研究中,随着Cs-4菌粉给药剂量增加,肝脏、肾脏、脾脏指数逐渐下降;Cs-4菌粉各给药组胸腺指数与空白组无显著差异,且各Cs-4菌粉给药组胸腺指数与阳性组差异极显著,说明蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉可以有效地保护荷瘤小鼠的免疫脏器。

IL-6是活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子,能使B细胞前体成为产生抗体的细胞;和集落刺激因子协同,能促进原始骨髓源细胞的生长和分化,增强自然杀伤细胞的裂解功能[9]。IFN-γ能活化中性粒细胞、NK细胞,刺激血管内皮细胞和白细胞合成的粘附分子,促进Th1细胞发育和抑制细胞活化与增殖,刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变[9]。Cs-4菌粉可使小鼠血清中IL-6、IFN-γ含量上升,说明蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉可以促进机体产生免疫因子进行免疫调节作用。TNF-α是一种由激活的巨噬细胞产生的能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子,是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一[10]。Cs-4菌粉可使小鼠血清中TNF-α含量上升,可能是通过增加血清中肿瘤细胞坏死因子含量而达到抗肿瘤作用。VEGF通过刺激血管新生促进肿瘤细胞的生长和转移,是目前发现的肿瘤血管生成过程中的重要调节因子,与肿瘤生长、浸润及转移相关,与肿瘤的恶性程度呈正相关[11]。Cs-4菌粉可降低VEGF含量,提示蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉可能通过抑制机体产生肿瘤生长因子而发挥其抗肿瘤作用。

肝内的AST有2种同工酶,分别存在于肝细胞的线粒体(mAST)和胞浆内(sAST),在肝细胞轻度病变时,仅sAST释放入血;而当病变严重时,mAST也会相继释放入血,故血清AST活性随肝细胞损害的程度增高[12]。BUN是人体蛋白质代谢的主要终末产物。氨基酸脱氨基产生NH3和CO2,两者在肝脏中合成尿素,通常肾脏为排泄尿素的主要器官,尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收,但肾小管内尿流速越快重吸收越少,也即达到了最大清除率,在肾功能损害早期,血尿素氮可在正常范围,当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时,血尿素氮的浓度才迅速升高[13]。Cs-4菌粉可降低血清AST、BUN含量,说明蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉可能减少荷瘤小鼠的肝肾损伤。

线粒体通路在细胞存亡机制中起着至关重要的作用,参与多种因素诱导的细胞凋亡,BCL-2、BAX、Caspase-3、P53均为线粒体通路相关的的重要蛋白[14]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一,是凋亡过程中最关键的凋亡执行蛋白酶[15]。Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用,BAX蛋白则有促进细胞凋亡作用,bcl-2基因和bax基因是目前已知的在凋亡调控过程中功能相互对立的一对最重要的调控基因,bcl-2、bax不但可作为Caspase-3的上游调控机制,参与对Caspase-3活性的调节,还可作为Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3的下游,两者在细胞凋亡传导过程中既相互联系又相互制约[16]。P53是公认的抑癌基因,位于人染色体17P13,P53蛋白能调节细胞周期和避免细胞癌变发生。本实验结果表明,蝙蝠蛾拟青霉菌可以使VEGF、BCL-2、P53蛋白表达下降,使BAX、Caspase-3蛋白表达上升。

综上所述,蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉具有明显的抗肿瘤作用,其作用机制可能与血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ、VEGF的含量变化,机体内VEGF、BCL-2、P53蛋白表达下降,BAX、Caspase-3蛋白表达上升有关,并且可降低血清中AST和BUN的含量,减少肝肾损伤。

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基金:国家中药标准化项目(ZYBZH-C-JX-39).