蒙古口蘑(Tricholomamongolicum)属于担子菌门(Basidiomycetes)、蘑菇目(Agaricomycetes)、口蘑科(Tricholomataceae)、口蘑属(Tricholoma)[1],主要分布在东北地区、河北张家口以北及内蒙古中东部草原[2]。蒙古口蘑最早记载于元代忽思慧的食疗学著作《饮膳正要》,称为“蘑菰”[3]。《蒙药正典》曾记载蒙古口蘑子实体具有治疗外伤及解毒的功效[4]。《中华本草》记载蒙古口蘑性平味甘,归肺、脾和胃经。蒙古口蘑有增强小鼠机体免疫功能的作用[5,6];蒙古口蘑菌丝体中的凝集素可激发小鼠脾细胞和腹膜巨噬细胞免疫调节细胞因子的基因表达[7];从菌丝体中分离得到的多糖肽复合物具有抗肿瘤活性和提高免疫力的作用[8];蒙古口蘑多糖有提高免疫力的作用[9]。笔者采用不同极性的溶剂提取蒙古口蘑子实体,探讨石油醚、乙酸乙酯和水提取物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响,为其子实体活性物质的深入研究奠定基础。

1、材料与方法

1.1材料与实验动物

蒙古口蘑(T.mongolicum)采自呼伦贝尔陈巴尔虎旗草原,由吉林农业大学中药材学院包海鹰教授鉴定。

SPF级昆明小鼠,体质量为18～22g,雌性,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供,许可证号:SCXK(辽)2015-0001。小鼠适应性饲养1周,室温(25±2)℃,湿度(55±5)%,自由进食饮水。

1.2主要试剂和仪器

注射用环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)为山西普德药业股份有限公司产品;盐酸左旋咪唑为汉中市天源动物药品有限公司产品;1%鸡红细胞、20%绵羊红细胞和10倍补体均为南京生航生物技术有限公司产品;瑞氏染液购自上海金穗生物科技有限公司;白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和免疫球蛋白A(immunoglobulinA,IgA)试剂盒均为吉林华纳德科技有限公司产品;一抗F4/80为圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司产品;二抗IgG为北京百奥莱博科技有限公司产品;DAB显色试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。RE-52AA旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品;ELX800酶标仪为美国BioTek公司产品。

1.3提取物制备

取1.25kg经40℃烘干的蒙古口蘑子实体放入9000mL石油醚中,60℃回流提取8h,用滤纸过滤,重复提取3次,合并提取液减压旋转蒸发,所得浸膏为石油醚提取物。石油醚提取后的子实体残渣继续用9000mL乙酸乙酯在80℃回流提取8h,过滤,重复提取3次,合并提取液减压旋转蒸发,所得浸膏为乙酸乙酯提取物。将乙酸乙酯提取后的子实体残渣在100℃依次用1500、1000、500mL蒸馏水分别煎煮40min,过滤,合并滤液,水浴浓缩30min,所得浸膏即为蒙古口蘑水提物。

1.4小鼠免疫抑制模型构建

将小鼠随机分为12组:空白组、模型组、阳性组、石油醚提取物高中低剂量组、乙酸乙酯提取物高中低剂量组和水提物高中低剂量组,每组16只。空白组常规饲养。药物用量均按小鼠体质量计算。模型组每天腹腔注射60mg·kg-1环磷酰胺,连续3d,第6天再以相同剂量腹腔注射1次[10]。其余各组在腹腔注射环磷酰胺的同时,阳性组每天灌胃50mg·kg-1盐酸左旋咪唑,石油醚和乙酸乙酯提取物高中低剂量组每天灌胃剂量均分别为30、20、10mg·kg-1,水提取物高中低剂量组每天灌胃剂量分别为1000、500、250mg·kg-1,连续14d,每天记录小鼠体质量。

1.5巨噬细胞吞噬功能检测

第14天灌胃1h后检测巨噬细胞吞噬功能,每组取4只,腹腔注射1%鸡红细胞1mL。30min后颈椎脱臼处死,仰位固定于鼠板上,腹腔注射生理盐水1mL,转动鼠板1min。吸取腹腔液0.5mL,平均分滴于两片载玻片上,用生理盐水漂洗,自然干燥,用甲醇溶液固定,瑞氏染液染色,干燥后用光学显微镜观察,记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数、巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数[11],计算吞噬百分率和吞噬指数。

1.6血清指标和脏器指数测定

每组取8只小鼠于第14天当晚禁食,第15天上午在无菌条件下眼球取血,1960g离心20min,取上清液,按照试剂盒说明书测定小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ和IgA的含量。颈椎脱臼处死小鼠取胸腺和脾脏称重,计算脏器指数。

胸腺指数=胸腺质量/mg小鼠体质量/g=胸腺质量/mg小鼠体质量/g

脾脏指数=脾脏质量/mg小鼠体质量/g=脾脏质量/mg小鼠体质量/g

1.7溶血素生成量测定

每组取4只小鼠在第15天上午分别腹腔注射20%绵羊红细胞0.2mL,再按照1.4的方法分别腹腔注射7d。7d后将小鼠在无菌条件下眼球取血制备血清[12]。将血清稀释100倍后依次分别加入各0.5mL的20%绵羊红细胞、100倍稀释的10倍补体和0.9%生理盐水,空白管用生理盐水代替血清。混匀,置于37℃恒温箱中放置1h,再冰浴5min,1960g离心15min,取上清液于540nm处测定吸光度值,并计算溶血素生成量。

溶血素生成量=样品血清的吸光度值×稀释倍数

1.8苏木精-伊红和免疫组织化学染色

分别将胸腺和脾脏用10%甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,苏木精-伊红染色后脱水封片,用光学显微镜观察组织的病理形态[13]。

免疫组织化学染色按照参考文献[14]的步骤操作,石蜡切片后用二甲苯常规脱蜡,依次用70%、80%、95%、100%的乙醇清洗,加入1滴1%甲醇双氧水,室温孵育10min,放入PBS洗涤液中孵育5min,将切片放入柠檬酸盐缓冲液中,在微波炉内微波辐射10min。降至室温后,用PBS清洗3次,洗涤后滴加封片液,温育20min,加入一抗(稀释比例1∶100),4℃过夜,PBS清洗3次,每次5min,加入二抗,37℃孵育20min,洗涤后用DAB显色试剂盒染色,PBS冲洗,苏木精复染,脱水,中性树脂封片,晾干后用光学显微镜观察小鼠胸腺和脾脏组织中F4/80蛋白质的表达情况。

1.9统计学处理

采用SPSS23分析所有数据,采用t检验比较两组的均数,采用单因素方差分析多组间显著性差异,数据以x¯±sx¯±s表示,P<0.05为组间差异具有统计学意义。

2、结果与分析

2.1体质量变化

空白组小鼠在14d之内随天数增加体质量不断增加;模型组小鼠从第2天开始体质量下降;阳性组、石油醚提取物各剂量组、乙酸乙酯提取物各剂量组、水提物各剂量组均在7d前不断下降,7d后不断增加(图1)。

图1蒙古口蘑子实体提取物对免疫抑制小鼠体质量的影响

2.2对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

与空白组相比,模型组小鼠巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数均显著降低(P<0.05)(表1)。从吞噬百分率方面看,与空白组相比,除石油醚提取物中低剂量组外,组间差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,乙酸乙酯提取物高低剂量组和水提物各剂量组间差异无统计学意义(P>0.05),阳性组、石油醚提取物各剂量组及乙酸乙酯提取物中剂量组显著升高(P<0.05)(表1)。从吞噬指数方面看,与空白组相比,阳性组、石油醚提取物各剂量组、乙酸乙酯提取物高中剂量组、水提物低剂量组均显著升高(P<0.05);与模型组相比,除水提物低剂量组外,其他各提取物组均显著升高(P<0.05)(表1)。

表1蒙古口蘑子实体提取物对巨噬细胞吞噬功能的影响

*：与空白组相比，组间差异具有统计学意义（P<0.05）；#：与模型组相比，组间差异具有统计学意义（P<0.05)

2.3对小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、IgA含量的影响

各提取物组血清中的IL-2含量与模型组相比均有升高趋势(P<0.05);各提取物组血清中IL-4含量与模型组相比均有升高趋势,也均具有显著性差异(P<0.05);各提取物组血清中的IFN-γ含量与模型组相比均有升高趋势,但仅阳性组、石油醚提取物高中剂量组及乙酸乙酯提取物中剂量组有显著性差异(P<0.05);除乙酸乙酯高低剂量组和水提物高剂量组外,各提取物组血清中IgA含量与模型组相比均有显著性差异(P<0.05)(表2)。

表2蒙古口蘑子实体提取物对小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、IgA含量的影响

2.4对小鼠脏器指数和溶血素生成量的影响

模型组胸腺和脾脏指数与空白组相比显著降低（P<0.05），表明模型建立成功（表3）。除阳性组、石油醚高中剂量组、乙酸乙酯中剂量组外，其余各提取物组与空白组相比无统计学意义（P>0.05），各提取物组胸腺指数与模型组相比显著升高（P<0.05）；除阳性组与石油醚高剂量组外，其余各提取物组与空白组相比无统计学意义，各提取物组与模型组相比脾脏指数都有提高（表3）。虽然各提取物组胸腺指数与脾脏指数均低于阳性组，但石油醚提取物高剂量组数值最接近阳性组，说明效果比其他各提取物组好。与空白组相比，阳性组、石油醚高剂量组、乙酸乙酯提取物中低剂量组和水提物各剂量组溶血素生成量有显著性差异（P<0.05）；除乙酸乙酯中低剂量组和水提物各剂量组外，与模型组相比，溶血素生成量显著升高（P<0.05）（表3）。

表3蒙古口蘑子实体提取物对小鼠胸腺指数、脾脏指数和溶血素生成量的影响

注同表1

2.5小鼠胸腺和脾脏组织病理形态学和F4/80蛋白质的表达情况

胸腺组织经苏木精-伊红染色可见,空白组胸腺细胞排列整齐规则,皮质细胞排列紧密,髓质细胞排列稀疏,皮质与髓质分界清晰,可见胸腺小体分布,并未发现组织病变坏死(图2A)。模型组胸腺出现多处细胞坏死,胸腺内细胞被大面积破坏,皮质与髓质分界不清晰,髓质细胞排列较稀疏,且未发现胸腺小体(图2B)。阳性组胸腺细胞得到显著恢复,皮质与髓质分界比较清晰,可见胸腺小体(图2C)。石油醚提取物组胸腺细胞修复较好,皮质与髓质分界清晰,胸腺小体清晰可见,其改善后的状态接近空白组小鼠,表明石油醚提取物剂量组对免疫抑制小鼠胸腺具有较强的修复能力(图2D)。乙酸乙酯提取物组胸腺病变情况得到一定改善,可见皮质与髓质较为清晰的分界线,但未见胸腺小体(图2E)。水提物组胸腺组织出现较明显的病变,髓质区增大,皮质区缩小,两者的分界线较为模糊也无法发现胸腺小体(图2F)。与模型组相比,石油醚提取物各剂量组可以显著改善环磷酰胺导致的小鼠胸腺病变情况,并且改善后的情况接近空白组小鼠。

脾脏组织经苏木精-伊红染色可见,空白组红髓与白髓清晰可见,并且界限分明,白髓颜色较深,表明淋巴细胞较多,脾小梁呈不规则分布,并未发现组织坏死(图3A)。模型组脾脏细胞出现大面积区域融化、坏死,炎症因子大面积浸润,坏死部位逐渐吞噬取代健康细胞,白髓与红髓界限模糊(图3B)。阳性组脾脏细胞排列出现微小层叠空隙,红髓与白髓两者分界清晰,脾小梁结构较为完整,表明脾脏损伤得到一定恢复(图3C)。石油醚提取物组脾脏组织结构损伤较轻,白髓与红髓分界较清晰,白髓结构完整,面积大于其他给药组小鼠脾脏的白髓,且存在较为明显的脾小梁组织结构,随着剂量的增加对小鼠脾脏损伤的改善也在提高(图3D)。乙酸乙酯提取物组红髓与白髓界限分明已经不明显,未见脾小梁结构(图3E)。水提物组红髓与白髓界限模糊,且组织发生病变,未见脾小梁结构(图3F)。与模型组相比,石油醚提取物各剂量组可以显著改善免疫抑制型小鼠脾脏病变情况,并且改善后的情况接近空白组小鼠。

图2采用苏木精-伊红染色法观察小鼠胸腺组织形态（400×）

A：空白组；B：模型组；C：阳性组；D：石油醚提取物组（1、2、3分别表示高中低剂量组）；E：乙酸乙酯提取物组（1、2、3分别表示高中低剂量组）F：水提物组（1、2、3分别表示高中低剂量组）；CO：皮质；M：髓质；TC：胸腺小体

图3采用苏木精-伊红染色法观察小鼠脾脏组织形态(400×)

A～F注同图2;WP：白髓；RP：红髓；T：脾小梁

模型组胸腺和脾脏见阳性表达,其细胞排列疏松,并有大面积组织坏死,表明有炎症因子浸润(图4B、5B)。阳性组未显示阳性反应,巨噬细胞数量较多,与空白组相似(图4C、5C)。石油醚提取物剂量组巨噬细胞排列较紧密,偶见带状细胞,但未发现组织严重坏死(图4D、5D)。乙酸乙酯提取物剂量组巨噬细胞排列紧密,但有细胞出现扭曲变形成椭圆形的现象,细胞有坏死现象发生(图4E、5E)。水提物剂量组巨噬细胞排列较疏松,有些细胞呈现带状及椭圆形,伴随大面积细胞坏死消融(图4F、5F)。与模型组相比,石油醚提取物各剂量组可以显著改善环磷酰胺导致的小鼠组织病变情况,并且改善后的情况接近空白组小鼠。

图4采用免疫组织化学染色法观察小鼠胸腺巨噬细胞(400×)

A～F注同图2

图5采用免疫组织化学染色法观察小鼠脾脏巨噬细胞(400×)

A～F注同图2

3、讨论

环磷酰胺作为广谱免疫抑制剂,可以干扰DNA及RNA,引起肝细胞坏死,造成激素水平及代谢紊乱,最终导致机体免疫功能降低[15,16]。胸腺和脾脏是动物机体重要的免疫器官,T、B淋巴细胞在此增殖分化,是机体免疫功能调节的重要场所,故其脏器指数可作为衡量机体免疫功能强弱的重要指标。本研究结果表明,蒙古口蘑的石油醚提取物各剂量组的小鼠胸腺指数和脾脏指数与模型组相比明显升高,作用效果显著,趋近于阳性组,表明其可以在一定程度上改善由环磷酰胺所导致的小鼠胸腺和脾脏的萎缩现象。

通过细胞吞噬实验与血清溶血素实验,30mg·kg-1石油醚提取物可以使吞噬百分率和吞噬指数显著升高,增强环磷酰胺引起的免疫低下小鼠的巨噬细胞吞噬能力,进一步促进机体非特异性免疫功能,且能使小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ和IgA的含量显著升高,可以有效提高受损伤免疫细胞的自我修复功能,进一步促进机体特异性免疫功能。

蒙古口蘑石油醚提取物主要化学成分为甾醇类物质[17,18,19]。樊晓飞等[20]及姜磊等[21]已研究证明甾醇类物质可以增强免疫活性,并在抗肿瘤方面也有较好的效果。本研究结果表明,蒙古口蘑石油醚提取物具有显著增强免疫功能低下小鼠的免疫活性,推测其发挥增强免疫作用的活性物质可能为甾醇类物质。此研究为蒙古口蘑增强免疫作用的进一步开发和利用供理论依据,但对其增强免疫的机制和活性化合物的结构还有待于深入研究。

参考文献：

[1]董冬,图力古尔.蒙古口蘑分类地位研究[J].菌物研究,2013,11(3):172-175.

[2]杨文胜.包头地区的食用和药用真菌[J].食用菌,1990,12(6):4-5.

[3]忽思慧.饮膳正要译注[M].上海:上海古籍出版社,2017.

[4]占布拉·道尔吉.蒙药正典[M].呼和浩特:内蒙古人民出版社,2007.

[5]王玉俊,刘开阳,孙黎,等.口蘑多糖对小白鼠免疫功能的影响[J].张家口医学院学报,1996,13(2):17-18.

[6]武春燕,冯福应.野生蒙古口蘑多糖通过NFE2L2通路对LPS诱导的巨噬细胞发挥抗炎和抗氧化调节作用[J].现代农业,2018(10):79-81.

[7]侯卓,张娜,王大为.蒙古口蘑多糖微波提取技术的研究[J].食品科学,2008,29(3):252-255.

[8]葛淑敏,于源华,张艳飞.蒙古口蘑多糖组分分析及结构初步鉴定[J].安徽农业科学,2009,37(1):192-193.

[9]姚庆智,何秀玲,张智毓,等.蒙古口蘑及其多糖提取物对小鼠免疫功能的影响[J].动物医学进展,2011,32(2):47-51.

[12]阮鸣,喻斌,霍光明,等.芝芪菌质提取物免疫活性研究[J].安徽医药,2018,22(10):1869-187

[13]韩玉,包海鹰,马列,等.白囊耙齿菌子实体提取物对小鼠慢性肾小球肾炎的预防与治疗[J].菌物学报,2019,38(3):428-439.

[15]康慧琳,樊卫平,雷波,等.不同剂量环磷酰胺对小鼠免疫功能的影响[J].免疫学杂志,2018,34(4):308-312.

[16]李璐,黄宏业,韦现色,等.不同剂量环磷酰胺对小鼠免疫功能抑制作用的研究[J].畜牧与饲料科学,2016,37(9):1-3,21.

[17]佟春兰,包海鹰,图力古尔.蒙古口蘑子实体石油醚提取物的化学成分及抑菌活性[J].菌物学报,2010,29(4):619-624.

[18]苏日古格.蒙古口蘑生物学特性､化学成分及抗肿瘤活性的研究[D].长春:吉林农业大学,2012.

[19]苏日古格,包海鹰,图力古尔,等.蒙古口蘑子实体的抗肿瘤活性[J].食品科学,2012,33(21):280-284.

[20]樊晓飞,杨明,姜磊,等.蝙蝠蛾拟青霉菌丝体化学成分的研究[J].菌物研究,2013,11(2):72-77.

[21]姜磊,包海鹰,杨明.蝙蝠蛾拟青霉菌丝体石油醚提取物抗肿瘤活性[J].食用菌学报,2010,17(4):58-60.､

刘颖,和生,魏颖,王玉悦,裴宏岩,包海鹰.蒙古口蘑子实体提取物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].食用菌学报,2020,27(04):91-100.