脂肪是一种重要的储能物质，为动物的生命活动提供能量。适量的脂肪沉积能帮助机体抵御外界的寒冷刺激，维持体温平衡。过多的脂肪沉积则会影响机体健康，还会影响肉质和风味。因此，研究者不断探索不同物种中脂肪的调控作用。我国北方寒冷地区冬季时间较长，对绵羊的生产性能、抗病性能以及抗寒性能均有较大影响。因此，为了解脂肪对绵羊机体的保温作用，需要更深入地研究其作用机制。miRNA在脂肪代谢中起到重要的调控作用，其主要通过调控相对应靶基因来调节脂肪细胞分化过程中的相关信号通路来帮助机体抵御外界的寒冷刺激。深入探究miRNA参与脂肪代谢调控机制的作用，对畜牧业的发展尤为重要。

1、冷应激的研究进展

1.1冷应激的定义

应激一般指动物机体受到大频率，时间长或持续时间虽短而反应剧烈刺激时所引起的反应。通常典型应激反应可分为3个阶段：惊恐和动员阶段，这是动物体对压力源的早期反应；适应和抵抗阶段，通过克服压力源使身体适应；精疲力竭阶段，表示为恐慌反应，其反应强度会迅速增加[1]。应激所引起机体的非特异性变化称之为全身适应综合征（generaladaptationsyndrome,GAS），凡能引起机体出现GAS的刺激均称为应激原，而冷刺激即为应激原之一。

动物长时间处于低温环境，机体会通过一系列生物学反应抵抗低温对身体的损害，称为冷应激反应。动物暴露在寒冷环境中几分钟到24h时出现急性冷应激，即警报反应。在报警反应消失后，动物处于稳定的冷刺激中，出现慢性冷应激。此时，儿茶酚胺和甲状腺素的含量分泌增多，能量代谢随之不断升高，而体热绝缘却不会受到影响，动物的适应能力延长，这种情况称为习惯或气候适应（acclimation)[2]。适当的冷刺激可以提高动物机体在低温环境下的生存能力，而过度的冷刺激可能会对其细胞发育、生产性能以及代谢功能等产生一定影响，从而阻碍机体的生长发育。因此，深入研究冷应激对动物机体的影响，对促进畜牧业的发展有一定的意义[3]。

1.2冷应激发生原理

冷应激会改变动物机体内环境稳定，随之对生理变化产生影响。机体的产热机制主要受神经内分泌系统和自主神经的双重调节[4]。当机体处在寒冷环境中，会激活中枢肾上腺素能神经元，从而调节外周自主神经活动，使外周交感神经和交感-肾上腺髓质（SAM）处于高度激活的状态，从而进一步导致肾上腺素（E）和去甲肾上腺素（NE）的合成、释放和周转增强[5]。此外，室旁核是下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）和下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT）活动的直接控制部位[6]。其中还有直接投射到正中隆起的促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）神经元和促甲状腺激素释放激素（TRH）神经元等。激活HPA是对应激的神经内分泌反应，HPA会引起肾上腺分泌类固醇激素。可见，在寒冷环境下HPA轴和SAM系统相互作用，CRH会使SAM的活力增强，从而引起血浆儿茶酚胺含量的增加。冷应激激活SAM系统，通过增加肾上腺髓质儿茶酚胺的合成和释放，促进HPA轴激活，在应激反应中形成CRH-NE-CRH正反馈调节系统[7]。

CRH是参与应激反应的主要调节者，能够激活CRH受体（corticotropinreleasinghormonereceptor,CRHR），刺激促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropichormone,ACTH）的分泌[8]。ACTH通过血液循环，作用于肾上腺皮质，促进胆固醇的摄取并向皮质醇和皮质酮转化。皮质酮在冷应激下对产热起到抑制作用。例如抑制冷应激下大鼠褐色脂肪组织（brownadiposetissue,BAT）线粒体解偶联蛋白（uncou-plingprotein1,UCP1）基因的表达，抑制BAT线粒体UCP的GDP结合,从而抑制BAT产热，防止冷应激引起产热过度而造成能量浪费。此外，褪黑激素、神经肽Y(NPY）、瘦素及增食欲素等均与冷应激有关[9]。动物对冷应激产生一系列抵抗、适应性的生理反应，以维持机体核心体温。

2、miRNA的研究进展

2.1miRNA的定义

微小RNA(miRNA）是机体内源性非编码小分子RNA，长度约为18～25个核苷酸（nt）。miRNA的主要功能是通过与信使RNA(messengerRNA,mRNA）的3'或5'端结合，在转录后对基因表达进行负调控，使mRNA降解或抑制其翻译[10,11]。1993年，Bartel等[12]在秀丽隐杆线虫（CaenorhabditisElegans,C.elegans）中首次发现miRNA-lin-4,7年后，在C.elegans中发现miRNA-let-7。研究发现，lin-4可以调控C.elegans的发育时序，而let-7则负责调控四期幼虫向成虫的转变。至今，研究者们通过多种方法在不同生物体中发现的miRNA高达几千种，并且具有高度保守性。

2.2miRNA的合成途径

现已知miRNA的合成途径有经典合成途径和Mirtron-miRNA合成途径[13]。

miRNA的经典合成途径包括细胞核中miRNA前体的生成和细胞质中成熟miRNA的形成两部分。首先，在RNA聚合酶II的作用下，miRNA基因被转录为长链初级转录本（pri-miRNA），长度可达几百到几千碱基。转录完成后，由不完全互补序列的pri-miRNA进一步折叠，形成二级结构复合物[14,15,16]。随后，Pri-miRNA在RNaseIII(drosha酶）和它的分子伴侣（digeorgesyndromecriticalregiongene8,DGCR8）的复合物作用下，被切割成长度大小为70～80nt、具有茎环结构的miRNA前体（pre-miRNA）。pre-miRNA通过Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白和输出蛋白5(exportin5）的作用，从细胞核内转运到细胞质中。之后，pre-miRNA通过核糖核酸内切酶Dicer的作用，被切割成较短的双链，其长度是21～25nt。而且它的5'端和3'端有2nt的悬垂序列，与siRNA的不完全配对双链RNA相似，它们是由成熟miRNA与成熟miRNA的伴侣miRNA*组成的二聚体。最终通过RNA解旋酶的作用生成成熟的miRNA和miRNA*。成熟的miRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）中发挥作用，而miRNA*被降解。研究表明，miRNA*的含量较高，同样有抑制靶点的能力[17]。

Mirtron-miRNA合成途径是Ruby等[18]在研究黑腹果蝇（drosophilamelanogster）和C.elegans的小RNA序列时被发现的合成途径。在Mirtron的合成途径中[19]，首先是内含子衍生为pri-miRNA。其次是pri-miRNA被剪接成去除内含子的mRNA和miRNA的套索结构。Berezikov等[20]在哺乳动物中筛选出3个新的mirtronmiRNA，即miR-1225、miR-877和miR-1224。同时，根据mirtron在无脊椎动物和在哺乳动物中的不同特点，mirtron-miRNA途径可能不同。

2.3miRNA调控基因的表达机制

miRNA与靶基因序列互补配对的形式不同使其调节靶基因的方式也不同。其调节方式分为2种：几乎完全与完全互补会导致靶基因直接被剪切或降解，多发生于植物中；而不完全互补则会抑制靶基因的翻译，多发生于动物中[21,22]。Nolo等[23]研究表明，lin-4和bantam可以诱导果蝇的生长同时可以抑制细胞的凋亡。另有学者发现，小鼠中的miR-196可以调节HOXB8基因的表达，从而调控小鼠的发育[24]。而miRNA在植物中与靶基因的互补程度较高，靶基因会被切割或降解。例如拟南芥（A.thaliana）中的miR-164与其靶基因nacl的信使RNA完全互补，使其靴基因被切割裂解[25]。

2.4miRNA的检测方法

成熟的miRNA片段比较短，其在细胞中表达水平较低，并且家族成员间的差距仅在1～2个碱基之间。所以，miRNA的检测技术在不断更新和发展。

2.4.1杂交检测法

杂交检测分为2种，即印迹杂交法和原位杂交法。RNA印迹（northernblotting）法是检测miRNA技术中最早建立的检测方法之一，被视为检测miRNA的标准法。该方法能够检测目标miRNA的长度以及验证预测的miRNA。通过提取总RNA样品，亲和层析分离纯化miRNA，经甲醛变性使大小不一的miRNA分离，用溴化乙淀染色进行质量检测。其次，将miRNA转移至尼龙膜上面，随后与靶miRNA进行互补探针杂交。最后，利用荧光或放射性元素检测其信号[26]。此方法的缺陷为样本需求量大、耗费时间、灵敏度低、检测效率低等。因此，大量学者研究出不同的改进方法。例如在Northernblotting杂交中引入锁核酸（LockingNucleicAcid,LNA），使用LNA所修饰的核苷酸序列可使检测灵敏度提高10倍，且能改善错配的特异性检测[27,28]。此外，使用可溶性的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）提高miRNA和尼龙膜的连接能力，致使miRNA检测灵敏度大幅度提高[29]。

原位杂交检测法是将靶miRNA固定在细胞中，随后利用碱基互补配对原则进行探针杂交，最终使用免疫组织化学法检测靶miRNA。结合酪酰胺信号放大技术（tyramidesignalamplification,TSA）和LNA技术研究出高效的原位杂交方法，提高检测灵敏度，低丰度miRNA也可以实现原位可视化。

2.4.2实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR）是一项重要的检测技术[30,31]。由于miRNA的核苷酸序列比较小，一般的PCR扩增具有局限性。为改善传统的PCR扩增法，研究人员建立了茎环法和加尾法等检测方法，提高miRNA检测的灵敏度。其中，加尾法使用末端转移酶将poly(A）尾巴与miRNA的3'端相连，从而使miRNA得到延伸，经逆转录得到足够长的cDNA。以此cDNA作为模板进行PCR扩增检测。加尾法更适合于检测样本量需求小（如血浆）的试验中的miRNA。而茎环法则是设计一个其3'端和miRNA5'端部分互补的长探针，将miRNA作为模板，进而逆转录出一条cDNA链，将这条cDNA作为模板进行扩增[32]。

2.4.3微阵列芯片和微球技术

基于微阵列的检测对检测多组miRNAs的效率较高[33]。微阵列的原理与RNA印迹法相似，目标miRNA与互补DNA探针之间进行特异性杂交。在其芯片上构建了互补的探针序列，通过靶miRNA和芯片杂交，最后去除未杂交部分，进行数据分析，实现miRNA的快速检测。其缺点在于灵敏度低、特异性不好、重复性低等。为克服以上缺点，有学者基于微阵列芯片构建了微球技术。其原理是各个微球等同于微阵列芯片的一个点，而其表面固定的DNA探针就有利于和靶miRNA部分互补配对，可避免芯片上的交叉反应，更好地实现特异性和重复性[34]。

2.4.4测序法

1977年，第一代测序技术，双脱氧核苷酸末端终止测序法被发现，通过双脱氧核苷酸中断合成待测碱基序列。化学降解法利用特定的化学试剂打断待测碱基序列，随后利用化学试剂或者放射性同位素通过标记特定序列获得测序结果。随着科研技术不断更新，新一代测序技术兴起。第二代测序技术的优势在于低成本和高通量，实现了真核生物的转录组测序和基因组测序。2006年，Illumina公司提出了新的测序方法GenomeAnalyzer。此方法同样是边合成边测序，但其测序系统操作简单、样品需求量小、成本低以及自动化程度高。近几年，出现的第三代测序技术，利用单分子测序不再是边合成边测序[35]。分别是Hlicos公司的单分子测序仪、OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子技术以及PacificBiosciences公司的SMART技术。以上技术都是利用荧光信号进行测序[36]。新的测序技术提高了测序的精准度。

3、miRNAs对脂肪代谢的影响

3.1脂肪的合成与分解

动物脂肪的沉积是脂肪合成代谢与分解代谢的一种平衡状态，脂肪沉积的能力受3方面的调控，即脂肪的合成、分解和脂肪酸的转运。通常机体通过2种不同途径合成脂肪：其一为小肠黏膜细胞由甘油单酸酯与脂肪酸合成脂肪；其二为肝细胞与脂肪细胞由甘油二酸酯合成脂肪。由于缺乏甘油激酶，脂肪细胞不能使用游离的甘油，从而用葡萄糖代谢的3-磷酸甘油来代替[37]。

3.2参与脂肪代谢相关基因

现今，研究较多在脂肪代谢中起重要作用的功能基因有过氧化物酶体增殖物激活受体家族（peroxisomeproliferators-activatedreceptors,PPARs），糖皮质激素受体（glucocorticoidrecepto,GR），脂肪酸合成酶（fattyacidsynthase,FAS），脂蛋白脂酶（lipoproteinlipase,LPL）以及硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-coenzymeAdesaturase,SCD）等。

PPARs属于类固醇家族成员，是II型核激素受体基因家族的一个亚家族[38]，是由配体激活的转录因子。PPARs调节基因转录的经典途径包括其通过与配体结合的初始激活与维甲酸X受体（retinoidXreceptor,RXR)RXR的异二聚化。PPAR-RXR二聚体与位于启动子或基因内区的DNA应答元件（PPRE）结合。同时，核受体共激活因子（co-activator）与PPAR-RXR协同作用并且补充和稳同活性转录复合体，其在肝脏、骨骼肌、肾脏、心脏和血管壁中高度表达，在脂肪和软骨中的表达量相对较低。当机体内发生脂肪细胞的分化时，PPARγ的含量也会增加。

GR是核受体超家族中的一员，其家族成员主要包括盐皮质激素受体、雄激素受体以及甲状腺激素受体等多种受体，被激活后通过与核内靶基因结合从而调控基因的转录。糖皮质激素（glucocorticoids,GCs）的功能受GR的介导。对于白色脂肪，GCs通过3种作用机制促进脂肪分解：增加甘油三酯脂酶和激素敏感脂酶的转录；对cAMP的浓度具有上调作用以及能够下调磷酸二酯酶3β活性；可以改变抑制性G蛋白。

FAS是脂肪酸合成过程中的限速酶，其数量和活性的强弱会直接影响脂肪酸合成的效率和数量。FAS在动物体内参与调控脂肪代谢，当机体产生的能量高于自身消耗的能量时，FAS的表达量便会升高，机体则会把吸收的多余能量转化为脂肪的形式储存在体内。近年来，研究者发现了许多参与脂肪代谢的新基因，为脂肪代谢的研究找到了新的突破点。

机体摄入大量营养物质，导致体内脂肪沉积过多从而引发肥胖症的发生。肥胖症在全世界范围内持续增加，因此，目前肥胖症成为主要的公共卫生问题[39]。Zhu等[40]研究发现，多巴胺受体D2(DRD2）与人体肥胖相关。此研究针对108名儿童与青少年进行长达8年的跟踪，对其体重、身高、饮食和运动展开调查，发现在DRD2的3个单核苷酸多态性中(rs1076562、rs2075654和rs4586205)只有rs2075654对减少肥胖症的发生具有统计学上的显著关联，说明DRD2极大可能参与脂肪代谢调控，对脂肪沉积有一定影响。此结论对今后DRD2的功能学研究奠定了基础。Rajaa等[41]研究发现，线粒体赖氨酸脱乙酰基酶（SIRT3）介导的脱乙酰基在驱动棕色脂肪组织（BAT）生热中起重要作用，并且SIRT3间接调节解偶联蛋白1(UCP1）生热。

3.3冷应激对脂肪代谢的影响

冷应激会对动物机体产生广泛作用，机体的多个系统都会受到冷应激影响。此外，冷应激对动物的能量代谢、免疫功能以及抗氧化功能等多方面产生影响。其中，能量代谢直接或间接影响机体抗氧化功能和生产性能等。

在冷应激下，动物的肌肉和肝脏中的糖原储存会降低，致使血糖浓度增加。Haman等[42]在冷环境下检测肌肉中葡萄糖、脂类以及血糖氧化率的变化，发现肌肉脂质过氧化产生的热量在机体能量物质总产热量中所占比重最大。李柔[43]研究表明，动物机体长期持续在10℃以下的冷暴露下，心脏mTOR通路的能量代谢相关基因表达发生上调，促进机体能量代谢，激活AMPK，通过抑制合成代谢过程，降低ATP的消耗，同时促进组织对糖的吸收、提高脂肪的分解速率以生成更多的ATP，最终维持机体能量平衡。杨莉[44]对阿勒泰羊及湖羊在冷应激下不同部位脂肪组织及肝脏中脂肪代谢相关基因表达的研究表明，在寒冷应激条件下脂肪酸的合成会降低，脂肪被分解供能，使机体适应冷环境，阿勒泰羊较湖羊的耐受冷应激的能力高，说明不同品种、品系对于应激的敏感性是不同的。SIRT3介导的各种组织中的线粒体调控以组织特异性方式存在，SIRT3调节不同组织中代谢途径的程度不同。Rajaa等[41]研究发现，SIRT3基因敲除（Sirt3KO）小鼠在急性冷应激的情况下会削弱BAT脂质含量的使用，使体温调节受到损害，增加BAT线粒体蛋白的乙酰化，以及增加在脂肪酸（FA）摄取和氧化中起关键作用的蛋白质中赖氨酸乙酰化作用。证明SIRT3介导的脱乙酰基在驱动BAT生热中起到至关重要的作用，而SIRT3间接调节解偶联蛋白1(UCP1）生热。

3.4参与脂肪代谢调控的miRNAs

Xu等[45]研究发现，miRNA在脂肪代谢中发挥重要的调节作用，从此揭开了研究miRNA在脂肪代谢中调节作用的热潮。脂肪代谢是比较复杂的过程，涉及脂肪的合成和分解，其过程由一些重要的调节功能基因相互协同作用完成。在不同条件下，部分miRNA在脂肪细胞分化过程中是正向调节作用，而另一些miRNA能够明显抑制脂肪细胞分化。另有研究发现，miRNA主要通过调控相对应靶基因来调节脂肪细胞分化过程中的相关信号通路，或者阻止细胞增殖从而促进或抑制脂肪细胞分化，最终起到调节脂肪代谢的作用[46]。

在果蝇脂肪组织中将miR-14分子进行缺失，发现甘油三酯的含量升高，致使果蝇增重明显。miR-278的突变可以使果蝇的脂肪含量和体重均下降。Kloting等[47]在研究肥胖模型小鼠时，在小鼠脂肪组织中检测到16个与脂肪含量有关的miRNAs。其中有7个miRNAs与脂联素、血浆葡萄糖消化率、白细胞介素6以及瘦素含量呈正相关，说明脂肪代谢的调控极大可能由miRNAs共同协调作用。林先滋[48]对奶山羊乳腺纽织乳脂代谢相关miRNAs的研究中发现，miR-23a不仅调控乳脂合成，还可调控体内固醇类物质的转运。此外，miR-23a对水解甘油三酯ATGL的基因有显著下调作用，说明miR-23a可能会使乳脂肪中的脂解作用降低。在猪脂肪沉积相关miRNA的研究中，从167个差异表达基因中筛选出3个与脂肪沉积相关的miRNAs，分别是ssc-miR-4338、ssc-miR-424和ssc-miR-545。这3个miRNAs均是通过靶向细胞色素丙酮酸脱氢酶激酶4基因（pyruvatedehydrogenasekinase4,PDK4）调控猪的脂肪沉积[37]。Bork等[49]研究表明，miRNA参与调控脂肪细胞的分化和代谢。如miR-17-92簇、miR-371、miR-378和miR-21可以促进脂肪细胞的分化及合成。反之，也有抑制脂肪细胞分化的miRNA，如miR-448、miR-369-5p、miR-138、let-7、和miR-130。Wang等[50]在研究诱导和激活体内3T3-L1前体脂肪细胞过程中，应用基因芯片技术，发现miR-17-92对Rb2/p130肿瘤抑制基因的表达过程中起负调节作用，对脂肪细胞的分化能力有提升作用。Kajimoto等[51]从小鼠miRNA文库中证实了65种与脂肪相关的miRNA。Esau等[52]研究发现miR-143可以抑制脂肪细胞的分化。

4、展望

有关绵羊脂肪相关miRNA的报道相对较少，对于功能研究更是微乎其微，主要研究都在绵羊不同组织或者不同品种间的miRNA筛选和表达谱验证。对于绵羊脂肪miRNA的生物学功能研究并不深入，miRNA调控脂肪代谢的机理尚不明确，且miRNA在绵羊脂肪沉积调控方面的研究未有报道。

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基金:新疆阿勒泰羊耐寒生物学特性及抗寒基因的筛选(CXRC201705)