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辣蓼总黄酮的安全性评价

2020-10-14 277 上传者：管理员

摘要：试验通过观察辣蓼总黄酮对小鼠的急性毒性和亚慢性毒性作用，开展安全性评价，为该药物后期研发和应用提供剂量支持。分别选取雌、雄各半的昆明系小鼠进行试验，设不同剂量的辣蓼总黄酮组和空白对照组。结果显示：小鼠对辣蓼总黄酮的最大耐受剂量大于5g/（kg·BW）；小鼠的亚慢性毒性试验期间，各试验组小鼠体重、增重率和饲料利用率与空白对照组相比均无显著差异（P>0.05）；小鼠个别血清生化指标与空白对照组有显著差异（P<0.05），但均在正常值范围内；组织病理学观察未见明显病理性损害。结果表明，辣蓼总黄酮对小鼠无急性毒性作用，长期连续用药也无亚慢性毒性作用，安全性较高。

关键词：
中兽药开发
亚慢性毒性
兽医学
安全评价
急性毒性
辣蓼总黄酮
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辣蓼属一年生草本植物，是一种传统中草药材，在医药、植物源农药等方面有较好的开发前景[1]。黄酮类化合物广泛存在于自然界多种植物中，是许多中草药的活性成分。国内外大量研究表明，黄酮类化合物具有镇痛、抗自由基、抗氧化、抗炎及抗肿瘤等作用[2,3,4,5,6]。而辣蓼总黄酮是辣蓼主要药理活性成分之一，具有抗氧化、抗微生物等功效[7]。依据《兽药研究技术指导原则汇编》[8]的相关规定，本研究进行辣蓼总黄酮的急性毒性和亚慢性毒性试验，为该药物的安全性评价和临床使用提供参考。

1、材料与方法

1.1试验动物及饲料

体重为（20±2)g、5～6周龄的SPF清洁级昆明系小鼠，购自广西医科大学实验动物中心，生产许可证号为：SCXK桂2014-0002；饲料为广西医科大学实验动物中心提供的小鼠全价饲料。

1.2药品及试剂

辣蓼黄酮中总黄酮含量为53.30%，由广西大学动物科技学院兽医药理实验室分离提取。血液生化指标试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他试剂均为常规试剂。

1.3急性毒性试验

将雌、雄各半的16只昆明系小鼠随机分为4组，雌、雄分笼饲养。试验前12h小鼠仅自由饮水，开始后24h内分2次按5.00g/(kg·BW)、2.50g/(kg·BW)和1.25g/(kg·BW)的剂量分别灌胃给予辣蓼总黄酮溶液，空白对照组给予生理盐水，每次0.6mL/只。连续观察7d并详细记录小鼠的饮食、饮水量变化及有无中毒或者死亡等临床表现，于第8d剖检观察试验小鼠的肝﹑心、脾﹑肺﹑肾及胃肠道等组织器官有无肉眼可见的病理变化。

1.4最大耐受量试验

选取雌、雄各半的20只昆明系小鼠不分组，但雌、雄分笼饲养。试验给药前12h仅自由饮水，开始试验后在24h内分2次按5.00g/(kg·BW)的剂量给予小鼠每次0.6mL的辣蓼总黄酮溶液灌胃，给药后正常饲养，24h内仔细观察其是否出现中毒现象，并连续7d观察小鼠的采食、饮水、精神、活动状况等，对死亡小鼠进行剖检。试验第8d剖检试验小鼠，观察并记录各组织器官的病理变化。

1.5亚慢性毒性试验

1.5.1动物分组与处理

将雌、雄各半的80只昆明系小鼠随机分为4组，即空白对照组、辣蓼总黄酮低剂量组[0.25g/(kg·BW）]、辣蓼总黄酮中剂量组[0.50g/(kg·BW)]和辣蓼总黄酮高剂量组[1.00g/(kg·BW)]，每组20只，雌、雄各半，分笼饲养，试验动物分组及处理见表1。

表1试验动物分组及处理

1.5.2测定指标及方法

试验前对各试验组小鼠进行称重。开始给药后连续28d，每天观察和详细记录小鼠的饮水、进食、精神状态等外表体征。给药第14d和28d时，各试验小鼠进行称重，且每组抽取10只小鼠采血并分离血清，分别测定谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总胆红素（TBILI）、碱性磷酸酶（AKP）及白蛋白（Ab）等生化指标。采血后处死小鼠，采心、肝、脾和肾等脏器进行称重，计算各试验组小鼠的脏器指数。

脏器指数（mg/g）=脏器重量（mg）/体重（g)(1)

同时取肝、脾、肾、胃肠、睾丸等组织脏器用10%中性福尔马林固定，备用于进行病理组织切片的制作和观察。

1.6数据统计与分析

数据统计均采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。结果用“平均值±标准差”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2、结果与分析

2.1急性毒性试验结果

小鼠的急性毒性试验中，各试验组小鼠临床上未见有任何中毒症状、饮食正常、精神状态良好、粪便硬度和颜色正常、体重增重正常、未见有死亡。剖检观察小鼠的肝﹑心、脾﹑肺﹑肾及胃肠道等组织器官，无肉眼可见的病理变化。结果显示，按5.00g/(kg·BW)的剂量范围内灌胃给予辣蓼总黄酮未测出小鼠半数致死量（LD50），需进行最大耐受量试验进一步检验辣蓼总黄酮的安全性。

2.2最大耐受量试验结果

最大耐受量试验过程中均未出现死亡情况。开始给药后24h内小鼠未出现中毒症状。连续观察7d，试验组小鼠饮食状态良好、呼吸、可视黏膜、被毛等体征均无异常表现；给药后第8d，剖检观察小鼠的肝﹑心、脾﹑肺、肾及胃肠道等组织器官，均无肉眼可见的病理变化。结果表明，小鼠对辣蓼总黄酮的最大耐受剂量为5.00g/(kg·BW)。

2.3亚慢性毒性试验

2.3.1小鼠用药后的临床表现及饲养试验结果（见表2)

试验期间，小鼠精神状态及活动无异常表现，粪便及饮食正常；由表2可知，为期28d的饲养试验中，辣蓼黄酮试验组增重率及饲料利用率与空白对照组比较，差异均不显著（P>0.05）。结果表明，辣蓼黄酮提取物对小鼠无明显不良影响。

表2小鼠用药后的临床表现及饲养试验结果

2.3.2小鼠用药后的脏器指数测定结果（见表3)

剖检结果显示，各试验组小鼠的心、肝、脾、肺和肾等脏器表面颜色均一、光泽度较好、质地结实、有弹性、形态无异常变化。由表3可知，给药后第14d和28d，不同剂量的辣蓼总黄酮试验组小鼠各脏器指数均呈无规律变化，但均在正常生理范围内。各剂量组与空白对照组相比较，差异不显著（P>0.05）。结果表明，经胃灌服辣蓼总黄酮不会导致小鼠实质脏器损伤或异常变化。

表3小鼠用药后的脏器指数测定结果

2.3.3小鼠用药后的血清生化指标测定结果（见表4)

由表4可知，用药后14d时，辣蓼总黄酮试验组小鼠总胆红素、白蛋白、碱性磷酸酶、谷草转氨酶、尿素氮数据总体呈降低的趋势，其中肌酐上升趋势明显，但与对照组比较差异不显著（P>0.05）；中剂量组的白蛋白与空白对照组相比较，差异显著（P<0.05），但均在正常值范围。

表4小鼠用药后的血清生化指标测定结果

用药后28d时，总胆红素、尿素氮、肌酐呈上升趋势，其中高剂量组总胆红素数据上升趋势明显，与空白对照组比较，差异显著（P<0.05）；白蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶及谷草转氨酶呈下降趋势，其中高剂量药物组的总胆红素、白蛋白与空白对照组比较，差异显著（P<0.05），中剂量组碱性磷酸酶与空白对照组比较，差异显著（P<0.05），低剂量组的尿素氮与空白对照组比较，差异显著（P<0.05）。

2.3.4脏器组织学形态学观察（见图1)

由图1可知，各试验组小鼠的心脏组织结构清晰，心肌细胞轮廓清晰、核质分明；肝及肾脏组织结构完整、结构可辨、高倍镜下细胞轮廓清晰、细胞核清晰可见；胃肠组织结构完整、黏膜上皮细胞清晰可辨、胃腺或肠腺结构轮廓完整、相互间界限明显；睾丸卵巢组织结构完整、结构清晰可辨、未见异常；不同剂量药物组脾脏脾小体结构清晰，0.25g/kg及1.00g/kg剂量的辣蓼总黄酮组小鼠的脾脏观察见脾小体体积微微增大、周围淋巴细胞密集、红髓区网状细胞增多。

图1辣蓼总黄酮对小鼠肝脏、脾脏、肾脏组织形态学的影响（H.E染色，×400)

3、讨论

辣蓼性温，有小毒[9]。研究表明，辣蓼含有黄酮类、挥发油及鞣质类等成分。黄酮类化合物是一种重要的植物次生代谢产物，可用于治疗胃肠道疾病、皮肤病、跌打肿痛等[10]。在兽医领域，黄酮类化合物可防治多种猪疾病，如仔猪黄白痢、猪球虫病等[11]。胡琴等[12]试验发现，葛根黄酮的体外抗氧化活性较强，能够明显清除自由基、氢氧根离子等。苦荞麸总黄酮和映山红花总黄酮都能够提高超氧化物歧化酶（SOD）的活力，增强细胞的抗氧化能力，减少细胞损伤，同时对心血管组织有明显的保护作用[13]。赖伟勇等[14]测得辣蓼LD50为128.3g/kg，说明辣蓼毒性很小，安全范围较大。

本研究通过急性毒性试验、最大耐受量试验及亚慢性毒性试验，从小鼠的精神、呼吸、行为、二便、血清生化指标及组织病理学等方面，对辣蓼总黄酮进行毒理学研究。结果显示，在急性毒性试验中，在5.00g/(kg·BW)体重范围内未出现中毒及死亡现象，连续给药的7d里小鼠的饲料利用率及增重率均表现正常，病理剖检观察试验小鼠的内脏器官均无明显的病变。在最大耐受量试验中，经连续7d观察试验小鼠的临床体征均无异常表现，系统解剖未发现小鼠内脏器官有任何肉眼可见病理变化，表明辣蓼总黄酮对小鼠无毒性作用，其最大耐受剂量为5.00g/(kg·BW)。

在连续28d的亚慢性毒性试验中，饲料利用率、增重率及各脏器指数与对照组比较有所降低，但均无显著变化。在血清生化检测中发现总胆红素在14d时略有升高但不显著，28d时1.00g/kg剂量组与空白对照组相比显著升高（P<0.05），说明辣蓼总黄酮可能具有一定的肝毒性[15]。尿素氮水平在28d时低剂量组也显著低于空白对照组（P<0.05）。有研究表明，尿素氮水平异常也预示着肝功能受损[16]。试验中碱性磷酸酶在14d及28d时均显著低于空白对照组（P<0.05），提示所提取的辣蓼总黄酮可能具有一定的肝毒性[17]，但上述肝毒性仅在高剂量组与空白对照组相比差异显著（P<0.05），即在中低剂量范围内依旧安全可靠，且组织病理切片观察均未发现明显的病理变化。而试验中不同剂量药物试验组小鼠的脾小体结构清晰，但0.25g/kg和1.00g/kg剂量辣蓼总黄酮组的小鼠脾脏观察到脾小体体积微微增大，周围淋巴细胞密集，红髓区网状细胞增多，提示有可能辣蓼总黄酮具有刺激免疫器官并提高免疫功能的作用[18]。

4、结论

辣蓼总黄酮无急性毒性作用，其最大耐受量为5.00g/(kg·BW)，在此范围内长期服用无毒副作用，临床应用安全性高。

参考文献：

[1]曾维爱,谭济才,谭琳,等.辣蓼的应用及其功效[J].中国农学通报,2006,22(8):369-372.

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[6]汤立建,赵良才,李庆林,等.黄芩黄酮类成分抗肿瘤作用及机制研究进展[J].中国中药杂志,2007,32(1):21-23.

[7]张国英,曾韬.辣蓼主要化学成分的研究[J].林产化学与工业,2005,25(3):21-24.

[8]兽药研究技术指导原则汇编[M].北京:化学工业出版社,2012.

[9]中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[10]胡晒平,刘强,刘杨,等.辣蓼的研究概述[C]//中华中医药学会中药化学分会第九届学术年会论文集.北京:中华中医药学会中药化学分会,2014.