摘要:为了解山羊LGALS1基因的遗传进化情况,根据NCBI中山羊LGALS1基因序列(登录号:XM_018048739.1)设计1对特异引物,采用RT-PCR技术从山羊睾丸细胞中扩增LGALS1基因,并将其克隆至pMD-19T载体,构建pMD-19T-LGALS1质粒,通过质粒PCR、双酶切和序列测序进行验证,对其核苷酸序列进行比对分析并绘制系统进化树。结果:山羊睾丸细胞LGALS1基因长度为408 bp,编码135个氨基酸。该基因与GenBank中登录的山羊LGALS1编码区序列相似性达100%;与绵羊、羚羊、水牛、牛、人、马、猪、猩猩、虎鲸、猫、驴、大熊猫、家鼠、斑马鱼的核苷酸一致性分别为99.3%、99.0%、97.1%、96.8%、87.3%、87.0%、88.5%、88.5%、90.9%、88.7%、87.0%、86.3%、84.3%、54.6%。系统进化树表明,山羊睾丸细胞LGALS1基因与绵羊、羚羊亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。结论:试验成功克隆了山羊睾丸细胞的LGALS1基因,不同物种内LGALS1基因高度保守。
半乳糖凝集素1(LGALS1/Galectin-1)是 Galectins家族的 15 个成员之一,大小约15 ku, 是第1个被研究并报道的哺乳动物半乳糖凝集素,能在多种免疫细胞中表达,如:树突状细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞等[1]。LGALS1是1种β-半乳糖苷结合蛋白,可调节免疫反应及炎症反应等过程,还可通过结合病毒蛋白或调节细胞内途径从而介导宿主与病毒的相互作用,对病毒感染有抑制作用[2]。例如:LGALS1与猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)的E蛋白相互作用可抑制PRRSV的复制[3];LGALS1特异性结合尼帕病毒(NiV)糖蛋白NiV-F和NiV-G(促进细胞间融合和合胞体形成),从而阻断病毒感染[4];LGALS1与塞卡病毒E蛋白结合时下调LGALS1表达量,可减少塞卡病毒的吸附与侵入等[5]。为进一步了解LGALS1基因的遗传进化情况,本试验以山羊为研究对象,从山羊睾丸细胞中克隆得到LGALS1基因,并对LGALS1基因的遗传进化进行初步分析,以期为进一步研究羊源LGALS1基因的功能奠定基础。
1、材料与方法
1.1 主要试剂
Trizol试剂、PrimeSTAR Max Premix(2×)、pMD19-T载体、DNA 连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ、XhoⅠ(购自 TaKaRa 公司),Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)逆转录试剂盒(购自翌圣生物科技有限公司),DH5a感受态细胞、2×PCR Master Mix、SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒[购自生工生物工程(上海)股份有限公司],DNA Marker DL 2 000、DL 5 000(购自Vazyme公司)。
1.2 主要仪器
PCR仪[型号:TC-96/G/H(b)B,BIOER公司]、电泳仪(型号:EPS300,Tanon公司)、凝胶成像仪(型号:Tanon-1600,Tanon公司)、台式高速冷冻离心机(型号:ScanSpeed 1730R,LA-BOGENE公司)、分光光度计(型号:NanoDrop One, Thermo Fisher公司)。
1.3 引物设计与合成
根据Genbank中登录的山羊LGALS1基因序列(登录号:XM_018048739.1),应用Primer Primier 5.0软件设计1对带酶切位点的特异引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成],下划线部分分别为BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。引物信息见表1。
表1 引物信息
1.4 山羊睾丸细胞总RNA提取及cDNA第一链合成
采用Trizol法提取山羊睾丸细胞的总RNA,使用分光光度计测定其浓度与纯度并记录数值,将A260 nm/A280 nm比值在1.8~2.1间的RNA使用Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)逆转录试剂盒逆转录合成cDNA第一链。反转录体系20 μL:5×gDNA digester Mix 3 μL,RNA模板2 μL,RNase-Free H2O 10 μL,4× Hifair® Ⅲ SuperMix plus 5 μL。反应程序:25 ℃孵育5 min, 55 ℃孵育15 min, 85 ℃孵育5 min。反应结束后将产物于 -20℃冰箱保存备用。
1.5 山羊睾丸细胞LGALS1基因PCR扩增
将反转录产物进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL:PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板cDNA 1 μL,ddH2O 20 μL。PCR扩增条件:98 ℃ 变性10 s, 60 ℃退火5 s, 72 ℃延伸60 s, 共35个循环。取扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像仪观察结果。
1.6 山羊睾丸细胞LGALS1基因的克隆与鉴定
采用SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒对LGALS1目的基因进行胶回收,将目的基因与pMD19-T载体连接,在PCR反应管中建立连接体系20 μL:pMD19-T载体2 μL,SolutionⅠ10 μL,回收目的DNA 8 μL。充分混匀,置于金属恒温仪16 ℃连接过夜。将重组质粒pMD19-T-LGALS1转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞,步骤如下:(1)取出大肠杆菌DH5a感受态细胞100 μL,冰上溶解后加入连接产物10 μL(连接产物不超过感受态细胞的1/10),轻摇混匀后冰上放置30 min, 每10 min轻弹1次,42 ℃热击90 s冰上放置1 min。(2)加入预热的LB液体培养基900 μL,混匀后37 ℃摇床培养1 h。(3)将菌液4 ℃ 8 000 r/min离心2 min, 弃去上清800 μL。(4)重悬菌体沉淀,将其涂布于含有氨苄西林(终浓度100 μg/mL)的LB平板培养基,正面放置,待完全吸收后倒置培养皿,37 ℃恒温培养12~16 h, 进行阳性克隆挑选。(5)挑选菌进行质粒PCR验证(方法同1.4),并使用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ进行质粒双酶切验证(阳性重组质粒约3 110 bp, pMD19-T空载体约2 700 bp, 目的基因约400 bp),在PCR反应管中建立酶切体系50 μL:BamHⅠ1 μL,XhoⅠ1 μL,缓冲液25 μL,pMD19-T-LGALS1 5 μL,ddH2O 18 μL。轻轻混匀后瞬时离心,37 ℃保温15 min。将鉴定为阳性的重组质粒送上海生物工程有限公司进行测序验证。
1.7 山羊睾丸细胞LGALS1基因序列分析
使用DNAStar的MEGA 5.0软件将克隆的山羊LGALS1基因与Genbank中其他14个物种(见表2)的LGALS1基因序列进行核苷酸同源性分析并绘制系统进化树。
表2 物种信息
2、结果与分析
2.1 山羊睾丸细胞LGALS1基因的PCR扩增结果
以反转录cDNA为模板,对LGALS1基因进行PCR扩增,经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析,得到长度为408 bp的片段,与预期相符(见图1)。
图1LGALS1基因PCR扩增结果
2.2 山羊睾丸细胞LGALS1基因重组质粒PCR鉴定结果
对克隆重组质粒进行PCR扩增,得到长度为408 bp的特异片段,与预期相符(见图2)。
图2 pMD-19T-LGALS1PCR鉴定结果
2.3 重组质粒双酶切鉴定结果
重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物长度分别为2 700 bp的pMD-19T载体和408 bp目的条带,与预期相符,表明LGALS1基因成功插入克隆载体(见图3)。
图3 pMD-19T-LGALS1质粒双酶切鉴定结果
2.4 山羊睾丸细胞LGALS1基因序列分析
测序结果表明,克隆的LGALS1基因与GenBank中登录的山羊LGALS1编码区序列(XM_018048739.1)相似性达100%。相似性比对结果显示,克隆山羊LGALS1基因与绵羊、羚羊、牛的同源性最高,核苷酸相似性均大于96%,与其他物种的核苷酸相似性介于54.6%~90.9%之间,其中与斑马鱼相似性最低(54.6%)(见图4)。系统进化树显示,LGALS1基因在山羊、绵羊、羚羊中为同一分支且亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远(见图5)。
图4LGALS1基因核苷酸序列比对结果
图5LGALS1基因核苷酸序列的系统进化树
3、结论
试验成功克隆了山羊睾丸细胞LGALS1基因;经核苷酸序列同源性比对及遗传进化树分析,山羊LGALS1基因种内高度保守,与绵羊、羚羊亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。
4、讨论
本试验结果表明,LGALS1基因CDS区长度为408 bp, 共编码135个氨基酸,与张凯等[6]、赵志峰等[7]对白来航鸡和梅花鹿的LGALS1基因研究结果一致。相似性比对及系统进化树显示,山羊LGALS1基因与同属动物的核苷酸一致性都在99%以上,与斑马鱼相似性最低(54.6%),与遗传距离结果一致,表明LGALS1基因具有较强的种属进化特异性和多样性,不同物种之间同源性越高,其进化关系越近。本试验克隆的山羊睾丸细胞LGALS1基因可为后续的抗羊LGALS1抗体制备和羊源LGALS1蛋白功能研究奠定基础。
参考文献:
[1]梁卫东,张树文,蔡晓宇,等.半乳糖凝集素1在退变椎间盘中的差异表达[J].中国组织工程研究,2023,27(35):5610-5615.
[6]张凯,夏宇欣,王立强,等.白来航鸡半乳糖凝集素-1基因克隆、生物信息学及组织表达特性分析[J].中国畜牧兽医,2022,49(10):3736-3745.
[7]赵志峰,孙红梅,张伟,等.梅花鹿GAL-1基因编码区克隆及表达检测[J].农业生物技术学报,2018,26(4):679-686.
基金资助:“宿主细胞LGALS1基因的克隆及表达分析”贵州大学SRT项目(贵大SRT字[2022]096号);
文章来源:张煜杭,郑维豪,姬格金等.山羊睾丸细胞LGALS1基因的克隆及序列分析[J].贵州畜牧兽医,2024,48(01):6-9.
分享:
猪流行性腹泻是一种以腹泻、呕吐、脱水等为主要特征的急性传染病,该病的爆发导致了大量猪死亡和养殖业的严重损失[1,2]。研究猪流行性腹泻的流行病学特征和传播途径,可以制定有效的防控措施,减少经济损失。
2024-04-21猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种病毒性疾病[1]。PEDV主要感染猪肠道,引起猪的腹泻、呕吐、食欲不振等症状。PEDV可通过粪便、呼吸道分泌物等途径传播,病毒颗粒在环境中具有较强的稳定性,容易在猪场等集约化养殖场所传播。PEDV对幼猪的影响尤其严重,感染后的幼猪易出现腹泻、呕吐等症状,病死率较高[2]。
2024-04-15鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)易感谱很窄,在自然感染条件下,只感染雏鹅和雏番鸭。感染雏鹅引发的疫病,我们通常称为小鹅瘟,流行范围很广,世界各地均有发生该病的报道。小鹅瘟是一种极烈性传染病,对20日龄以内的雏鹅,不仅传染速度快,病死率高,而且越小日龄感染率和病死率越高,甚至可达100%[1]。该病毒感染后可引起雏鹅多器官炎症,如急性肠炎、肝炎、肾炎等[2]。
2024-04-10铁(Fe)是动物机体进行生理活动必需的元素,在生物代谢过程中发挥重要作用[1]。铁常以亚铁(Fe2+)、铁(Fe3+)的形式存在,具有很强的氧化还原性质[2]。过量铁具有极强的毒性,机体铁超载会引起血色素沉着症[3]、肝损伤和癌症等[4,5]。鸡饲养标准(NY/T 33-2004)规定:雏鸡饲料中铁最大耐受量为500 mg/kg。
2024-03-20猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是影响养猪业的重要疾病之一[1],该病还会产生免疫抑制,继发其他细菌和病毒感染[2],对养猪业造成极大的影响。猪体感染病毒后会抑制Ⅰ型干扰素的表达[5],引起免疫抑制,猪接种PRRSV活疫苗3~4周后才能产生细胞免疫应答和中和抗体,但中和抗体滴度不高[6],这些现象为PRRSV的防控带来了巨大的挑战。
2024-03-20半乳糖凝集素1(LGALS1/Galectin-1)是 Galectins家族的 15 个成员之一,大小约15 ku, 是第1个被研究并报道的哺乳动物半乳糖凝集素,能在多种免疫细胞中表达,如:树突状细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞等[1]。LGALS1是1种β-半乳糖苷结合蛋白,可调节免疫反应及炎症反应等过程,还可通过结合病毒蛋白或调节细胞内途径从而介导宿主与病毒的相互作用,对病毒感染有抑制作用[2]。
2024-03-04畜牧养殖业在国民经济发展进程中扮演着重要的角色。为促进行业在新时期获得更好地发展,需要从多方面出发,加强绿色畜牧养殖技术的推广与应用,科学开展管理,督促其高质量开展饲养管理工作,应用科学化、生态化的养殖管理模式,生产高质量畜牧产品,满足当前人们的生活需求。
2024-02-19在生猪养殖等领域,精液质量评估是促进生产的重要环节,其中一个重要指标———精子活力,是指精液中呈前进运动的精子所占的百分率。传统的手工分析方法是用显微镜进行观察,对精子运动情况进行人工判断和计数,该方法对检测人员要求高,主观性强,准确度低。
2024-02-18随着生猪养殖集约化、规模化的快速发展,在养殖过程中母猪易处于生理应激状态,导致机体免疫力下降及氧化应激等[1]。母猪机体免疫力低极易降低胎儿的成活率及哺乳仔猪的健康状态,因此改善妊娠母猪机体的健康,可以为新生仔猪提供母源免疫保护,增强仔猪机体的免疫力,提高养殖的生产效益及经济效益[2]。
2024-02-07板青颗粒是采用十字花科植物菘蓝地下部分的根(板蓝根)和地上部分的叶子(大青叶),经干燥后,使用低温萃取的方法提取有效成分制成的颗粒,具有清热解毒、消肿散结、强心利尿利胆、抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力的功效。黄芪多糖是黄芪的干燥根茎浓缩提取而成的干燥粉末,具有清热解毒、补气、激活机体器官免疫功能、促进抗体生成、提高抗病力、增加采食量等功效。
2024-02-06人气:6488
人气:4869
人气:4492
人气:4205
人气:4146
我要评论
期刊名称:畜牧兽医学报
期刊人气:1741
主管单位:中国科学技术协会
主办单位:中国畜牧兽医学会
出版地方:北京
专业分类:农业
国际刊号:0366-6964
国内刊号:11-1985/S
邮发代号:82-453
创刊时间:1956年
发行周期:月刊
期刊开本:大16开
见刊时间:一年半以上
影响因子:0.191
影响因子:0.518
影响因子:0.270
影响因子:0.956
影响因子:0.000
400-069-1609
您的论文已提交,我们会尽快联系您,请耐心等待!
你的密码已发送到您的邮箱,请查看!