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铁过量致雏鸡脾氧化应激及病理组织学观察

2024-03-20 10 上传者：管理员

摘要：为探究过量铁对雏鸡脾脏病理损伤和氧化应激的影响，将75只15日龄健康白羽肉鸡随机分为3组，每组雏鸡基础日粮中分别添加硫酸亚铁50、500、1 000 mg/kg,连续饲喂3 d,于铁过量后1、3、7、14、21 d取各组雏鸡脾脏，测定铁含量、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、过氧化氢(H2O2)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)和总抗氧化能力(total-antioxidant capacity, T-AOC),计算脾脏器官指数并进行病理组织学观察。结果显示，过量铁刺激雏鸡脾脏肿大，铁过量后1～14 d雏鸡脾脏铁含量明显增加(P<0.01);铁过量后1～21 d CAT、GPx活力和T-AOC水平显著降低(P<0.05或P<0.01),但MDA和H2O2含量显著提高(P<0.05或P<0.01)。病理组织学观察显示，铁过量后雏鸡脾脏淋巴细胞排列混乱，红细胞及嗜中性粒细胞散在分布，脾小体数量增多且结构模糊，红髓占比增加，红髓内含铁血黄素沉积。表明过量铁导致脾脏发生氧化应激，组织结构损伤，从而影响脾脏免疫功能，导致免疫功能下降。

关键词：
氧化-抗氧化
病理组织学
脾脏
铁过量
雏鸡
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铁(Fe)是动物机体进行生理活动必需的元素，在生物代谢过程中发挥重要作用[1]。铁常以亚铁(Fe2+)、铁(Fe3+)的形式存在，具有很强的氧化还原性质[2]。过量铁具有极强的毒性，机体铁超载会引起血色素沉着症[3]、肝损伤和癌症等[4,5]。鸡饲养标准(NY/T 33-2004)规定：雏鸡饲料中铁最大耐受量为500 mg/kg。过量铁可导致肉鸡体重、生长性能、腹脂率和肉质水平严重降低[6],但是过量铁对雏鸡免疫器官的影响研究较少。脾脏作为体内最大的外周免疫器官，容易受到重金属毒性影响[7],是铁超载时主要靶器官之一。氧化应激是指氧化剂的产生和抗氧化剂的防御之间的不平衡，可导致生物系统的损害[8]。试验证明，许多重金属可使动物组织中MDA、NO含量升高，GPx、CAT等抗氧化物质减少或功能减弱，导致自由基聚集并引发疾病[9,10]。本研究通过对雏鸡脾脏氧化与抗氧化功能的检测，并结合病理组织学变化，探讨过量铁对雏鸡脾脏的氧化应激损伤机制，为铁的合理利用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物

75只1日龄健康白羽肉鸡，哈尔滨先锋孵化场提供，自由饮食饮水，适应性饲喂14 d。

1.1.2 主要试剂

丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及铁含量检测试剂盒，南京建成生物工程研究所产品；普鲁士蓝染色试剂盒，索莱宝科技有限公司产品；苏木素染液、伊红染液，东北农业大学病理生理实验室提供；硫酸亚铁(FeSO4·H2O),纯度≥91.4%,四川龙蟒集团产品。

1.1.3 主要仪器

酶标仪(ELx808),美国Bio-Tek仪器有限公司产品；小型台式冰冻离心机(Eppendorf 5430/R),艾本德中国有限公司产品；SCIENTZ-48L冰冻型高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；轮转切片机(HM340E),MICROM国际股份有限公司产品；NIKON ECLIPSE 80i共聚焦荧光显微镜和NIS-Elements病理成像系统，尼康仪器(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验动物处理

将75只15日龄健康白羽肉鸡随机分为3组：对照组(Control)、铁过量1组(E1)和铁过量2组(E2);将硫酸亚铁水合物(FeSO4·H2O)溶于水并和饲料充分搅拌，分别在饲料中添加50、500和1000 mg/kg, 连续饲喂3 d。于铁过量后1、3、7、14、21 d各组随机抽取5只雏鸡，称重，心脏采血致死，取脾脏，观察大体形态并称重。取部分脾脏置于100 mL/L中性福尔马林固定，4℃保存，剩余脾脏分装于-80℃保存。

1.2.2 检测指标及方法

1.2.2.1 铁含量检测

将40 mg脾脏放入装有400 mL生理盐水的EP管中，振荡匀浆，取上清，按检测试剂盒说明操作，测量520 nm吸光度值(OD值),并根据以下公式计算：

组织铁含量(μmol/g)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度÷待测蛋白浓度(g/L)。

1.2.2.2 MDA及H2O2含量测定

将15 mg脾脏放入含有135 mL生理盐水的EP管中，振荡匀浆，取上清，按照试剂盒说明书检测，分别在波长532 nm和405 nm测量MDA及H2O2吸光度值(OD值),并根据以下公式计算：

MDA含量(nmol/mg)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度÷待测蛋白浓度(nmol/mg)。

H2O2含量(nmol/g)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度÷待测蛋白浓度(nmol/g)。

1.2.2.3 CAT、GPx活力和T-AOC水平测定

将30 mg脾脏放入含有270 mL生理盐水的EP管中，振荡匀浆，取上清，按照试剂盒说明书检测，分别在波长405 nm和520 nm下测量CAT、GPx吸光度和T-AOC吸光度值(OD值),并根据以下公式计算：

CAT活力(U/mL)=(对照OD值-测定OD值)×271/(60×取样量)/待测样品蛋白浓度(mg/mL)。

GPx活力(U/mg)=(非酶管OD值-酶管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度÷待测蛋白浓度。

T-AOC(U/mg)=(测定OD值-对照OD值)/0.3×(反应液总量/取样量)×匀浆蛋白液浓度(mg/mL)。

1.2.2.4 脾脏器官指数

记录雏鸡和脾脏重量，观察大体形态，根据公式计算脾脏器官指数：脾脏指数=脾脏重量(g)/体重(kg)。

1.2.2.5 病理组织学观察

脾脏经10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、HE染色和普鲁士蓝染色。

1.2.2.6 数据处理

试验数据用GraphPad Prism 9.5软件进行双因素方差分析，并制作图表，所有数值以“平均值±标准差”表示。

2、结果

2.1 雏鸡铁过量后脾脏铁含量变化

铁过量后1～14 d, 雏鸡脾脏铁含量极显著高于对照组雏鸡(P<0.01);1～7 d后铁过量2组雏鸡脾脏铁含量显著或极显著高于铁过量1组(P<0.01或P<0.05)(图1)。

图1 雏鸡铁过量后脾脏铁含量变化

2.2 雏鸡铁过量后脾脏MDA及H2O2含量变化

铁过量后1～21 d, 除铁过量1组14 d MDA含量无显著变化外，雏鸡脾脏MDA及H2O2含量均显著或极显著高于对照组(P<0.01或P<0.05);铁过量2组MDA及H2O2含量于铁过量后1～14 d极显著高于铁过量1组(P<0.01)(图2、图3)。

2.3 雏鸡铁过量后脾脏CAT、GPx和T-AOC变化

铁过量后1～21 d, 雏鸡脾脏CAT、GPx活力和T-AOC水平均显著或极显著低于对照组(P<0.01或P<0.05 );铁过量2组显著或极显著低于铁过量1组(P<0.01或P<0.05)(图4～图6)。

图2 雏鸡铁过量后脾脏MDA含量变化

图3 雏鸡铁过量后脾脏H2O2含量变化

图4 雏鸡铁过量后脾脏CAT活力变化

图5 雏鸡铁过量后脾脏GPx活力变化

2.4 雏鸡铁过量后脾脏器官指数及眼观病理变化

雏鸡铁过量2组脾脏指数1～3 d显著或极显著高于对照组(P<0.01或P<0.05),仅在1 d显著高于铁过量1组(P<0.05)(图7)。雏鸡铁过量后1～7 d, 脾脏颜色暗红、不同程度肿大或充血，1周后恢复正常(图 8)。

图6 雏鸡铁过量后脾脏T-AOC变化

图7 雏鸡铁过量后脾脏器官指数变化

图8 雏鸡铁过量后脾脏眼观病理变化

2.5 雏鸡铁过量后脾脏病理组织学观察

HE染色显示，铁过量2组脾脏组织细胞排列混乱，网状内皮细胞增生。红髓内有散落的红细胞及嗜中性粒细胞，部分脾细胞及淋巴细胞皱缩。白髓和红髓结构模糊，白髓占比减少，红髓占比增大。白髓脾小体变大且结构模糊，淋巴细胞减少，动脉周围淋巴鞘显著增厚(图9C)。铁过量1组脾脏动脉周围淋巴鞘显著增厚，红髓内有红细胞及嗜中性粒细胞(图9B)。普鲁士蓝染色显示：两组雏鸡脾脏红髓和白髓均有铁血黄素，并且铁过量2组蓝染含铁血黄素颗粒较1组增多(图9E、9F)。

图9 雏鸡铁过量后脾脏病理组织学变化(7 d)

3、讨论

MDA是脂质过氧化反应的副产物，是衡量组织氧化损伤的指标[11]。铁过量后，雏鸡脾脏MDA含量显著升高(P<0.05),且随着铁含量的增加而增加。过量铁会造成雏鸡肝脏MDA含量升高[9];铁超负荷导致小鼠肾脏损伤，发生脂质过氧化和MDA升高[12]。铁超负荷条件下自由基增加被认为是由于脂质过氧化作用增加和抗氧化防御系统损伤造成的，Fe2+直接或间接与不饱和脂肪酸反应导致脂质过氧化[13],产生大量MDA。本试验中铁过量组雏鸡脾脏H2O2含量显著升高。雏鸡铁过量后，脾脏产生大量O-2·,SOD酶将过量O-2·转化为H2O2,Fenton反应消耗的H2O2以及GPx和CAT水解的H2O2不足以抵消掉产生的量[14],因此，雏鸡铁过量后脾脏内H2O2含量升高。铅中毒使鸡免疫器官MDA和H2O2含量上升[15],与本试验结果一致。铁过量后，脾脏氧化物质MDA和H2O2含量升高，表明铁过量可导致脾脏氧化功能增强。 GPx、CAT等抗氧化物酶主要负责清除体内H2O2以防止机体氧化损伤[16]。铁过量后雏鸡脾脏GPx和CAT活力显著降低，CAT活力在铁过量后1周达到最低。本试验中雏鸡铁过量后脾脏T-AOC显著降低，表明铁过量使脾脏抗氧化能力降低。铁过量后雏鸡脾脏氧化抗氧化失衡，短时间内氧化功能增强，抗氧化功能减弱，脾脏发生氧化应激。

铁过量后，雏鸡脾铁含量显著升高，脾急性肿胀。铁过量后雏鸡脾脏组织结构损伤，细胞排列混乱。红髓内出现散落的红细胞及嗜中性粒细胞，动脉周围淋巴鞘显著增厚，说明脾脏遭遇抗原刺激引起免疫应答。雏鸡摄入过量铁后，白髓占比减少，脾小体数量增多，且结构模糊，淋巴细胞数量减少，机体免疫功能下降。普鲁士蓝染色显示铁过量后，雏鸡脾脏红髓分布有蓝染含铁血黄素，且随铁剂量的增加含铁血黄素分布越广泛。以上结果证明脾脏吸收铁的能力有限，雏鸡摄入过量铁后，铁会在脾脏中沉积并造成组织结构损伤，进而影响脾脏免疫功能。

综上所述，摄入过量铁后，雏鸡脾脏MDA、H2O2含量升高，CAT、GPx活力、T-AOC水平降低，表明过量铁可致雏鸡脾脏氧化水平升高，抗氧化能力下降，机体处于氧化应激状态。脾脏作为体内最大的外周免疫器官，是铁超载时的靶器官之一，铁过量后，脾小体数量增多且结构模糊，组织结构损伤，过量铁通过氧化应激导致脾脏组织损伤，从而影响脾脏免疫功能。

参考文献:

[6]宋丹,杨柳,邹亚学,等.饲粮铁水平对肉仔鸡生长性能､胴体性能及肉品质的影响[J].中国饲料,2021(17):70-74.

[9]孙凤娇,张靓玉,安裕智,等.雏鸡铁过量后肝氧化应激及组织病理学变化[J].中国兽医科学,2022,52(5):648-653.

[15]杨凯.鸡免疫器官的铅中毒及硒对铅毒性的缓解作用[D].黑龙江哈尔滨:东北农业大学,2016.

基金资助:黑龙江省自然科学基金项目(LH2023C020);

文章来源:安裕智,孙宁,孙凤娇等.铁过量致雏鸡脾氧化应激及病理组织学观察[J].动物医学进展,2024,45(03):54-58.