玉米赤霉烯酮(ZEN)又称F-2毒素，主要存在于发霉的玉米、小麦、大麦等谷物及副产品中。有研究发现，ZEN在玉米和玉米起源的植物中污染最为频繁[1]。我国玉米中ZEN检出率较高，在80%以上[2]。ZEN可通过霉变的玉米等谷物及副产品被动物吸收，从而使动物主要出现亚急性和慢性中毒；此外ZEN可以通过被污染的谷物和动物性食品直接或间接地进入人体，给人类健康造成极大的危害。加之我国饮食习惯偏好以谷物作为主食，使得ZEN的危害更为突出。基于ZEN污染的广泛性和其对人类和动物的高危性，对于ZEN的脱毒问题愈发显得重要和迫切。相较于传统的物理和化学脱毒法存在的诸多局限性，生物法降解ZEN因微生物来源广泛、酶反应条件温和以及脱毒效率高等诸多优势逐渐成为ZEN脱毒研究中的热点。本文总结了ZEN的危害及其在玉米及其副产物中的污染现状，并在此基础上综述了利用生物降解法对ZEN进行脱毒的研究进展，为饲料中ZEN的生物脱毒相关领域研究及应用提供可行理论和实践依据。

1、ZEN危害及限量标准

ZEN是镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物，为2,4-二羟基苯甲酸内酯类化合物[3]。迄今为止还发现了ZEN的6种主要衍生物，包括α/β-玉米赤霉烯醇(α/β-ZOL)、α/β-玉米赤霉醇(α/β-ZAL)、玉米赤霉酮(ZAN)和β-雌二醇[4]。据报道，ZEN的β型衍生物毒性较低，而α-ZOL和α-ZAL的雌激素毒性高于ZEN。ZEN在霉变谷物中含量最高，它对环境变化和热处理不敏感，因此，在饲粮储存和加工过程中保持稳定，其污染广、毒性大[5],在造成严重饲粮污染的同时，还会随着食物链在动物机体内不断累积。由于ZEN的酚二羟基内酯结构与β-雌激素类似，故其进入人和动物体后可竞争性地与机体内的雌激素受体(ER-α和ER-β)结合，进而引发一系列的生殖毒性、致癌毒性、基因毒性和免疫毒性[6,7]。动物食用被ZEN污染的饲料会导致采食量减少、饲料转化率降低，引发急慢性中毒、繁殖机能紊乱等症状，严重者可导致死亡[8];人类食用被ZEN污染的食物后会导致肝癌、睾丸癌及青春期早熟等疾病[9],危害身体健康。

ZEN已被国际癌症研究机构(IARC)归为第三类致癌物质，因此世界各国早已对人类食用的谷物及其制品，以及动物饲料中ZEN含量都制定了严格限制标准。

世界粮农组织规定人体可接受的ZEN每日摄入量最大限值为0.5 μg/kg[10]。欧盟规定在谷物及其制品中ZEN含量不可高于100 μg/kg, 在婴幼儿食品中则要求更严格，不可高于20 μg/kg[11]。GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中规定，ZEN在谷类及其制品中的含量不得超过60 μg/kg[12]。GB 13078—2017《饲料卫生标准》中也对饲料原料和饲料产品的ZEN含量有着严格限量标准[13],见表1。

表1 饲料原料中ZEN的限量标准[13]

2、ZEN在玉米及其副产物中的污染现状

我国植物性饲料原料遭受霉菌毒素污染现象普遍存在，其中在各类原料中有不同的污染特点，在玉米类原料中ZEN的污染情况较为严重。玉米作为我国第一大作物，80%～90%的玉米被人直接或间接食用，其中饲料用玉米超过50%,所以保障玉米的质量安全和稳定是保证饲料质量的关键，而玉米在种植、收割、贮存和生产加工过程中容易遭受霉菌的污染。被霉菌感染后，玉米及其副产品在加工及储存过程中适宜的温湿度环境有利于ZEN的形成[14],因此玉米副产品ZEN含量超标更为普遍。近年来，很少学者对我国不同地区玉米及其加工产品采样分析，ZEN检出情况见表2[15,16,17,18,19,20,21,22]。

研究发现，ZEN对动物饲料和粮食的污染状况呈现出明显的地域性差异[14]。为了掌握真实的ZEN污染情况，国内科研人员通过对不同地区的谷物饲料进行采样分析，结果发现，在许多谷物及副产品中均存在较高水平的ZEN检出率和超标率。黄志伟等[15]对12种共计386份植物性饲料原料进行采集和检测后发现，玉米及其加工产品、小麦及其加工产品、饼粕类和其他原料均受到霉菌毒素污染，其中ZEN污染率最高的是玉米及其加工产品，平均检出率为51.7%,最大检测值为1 050 μg/kg, 对饲料产品质量造成严重危害。在2021年调查国内玉米、杂粕、小麦等饲料原料中霉菌毒素污染情况发现，各类饲料原料均不同程度地受到ZEN污染，玉米副产物中ZEN含量最高，检测均值高达1 425.23 μg/kg[22]。ZEN污染问题不仅仅存在于国内，也是全球性的普遍问题。Rashedi等[23]采集玉米、大麦、青贮料及小麦麸皮共计54份样品，检测发现玉米样品中ZEN的污染浓度在所有样品中最为严重，检出率约为25%,污染浓度达150 μg/kg。Pleadin等[24]在克罗地亚对当地的玉米粉、大麦等多类谷物粮食样品采用酶联免疫法进行了ZEN浓度的检测，其检测结果显示玉米中ZEN污染程度最高，ZEN检出率达到78%,其污染值为187.74 μg/kg, 在另外的3种谷物样品中也均检测到了ZEN污染。2018年南非研究人员调查了津巴布韦的玉米收割前后各个时期的ZEN含量变化，发现玉米收割前检测到ZEN污染值为44.6 μg/kg, 在玉米仓储前的ZEN污染值达到最高，检测值为73 μg/kg[25]。由于污染变异大，国外玉米及其副产品中受到ZEN污染的严重程度有可能与其原料品质以及加工工艺的控制有关。总体上来说ZEN的污染问题对于各个国家都是需要引起重视的问题。

表2 国内玉米及其加工产品中ZEN检测结果分析

3、ZEN生物脱毒研究现状

目前，去除ZEN及其衍生物的方法有物理法、化学法和生物法。物理法采用高强度加热、辐照和吸附来减少ZEN,往往无法完全去除ZEN;化学法包括碱水解、臭氧氧化和氨化等，由于其高风险和低效率，易造成二次污染等弊端而无法满足实际生产应用[26]。相较于这2种脱毒方式存在的局限性，生物降解法一是利用微生物菌体吸附毒素达到脱毒效果，二是微生物在生长代谢过程中产生的次级代谢物或酶在温和的条件下特异性地降解ZEN形成毒性较小或者无毒的降解产物[27]。生物脱毒法在可进行规模化操作的同时还不会破坏饲料中的营养成分，并具有较强的特异性和专一性，高效环保以及避免二次污染等优点，在ZEN降解方面具有显著优势，被认为是食品和饲料脱毒的最佳方法。

3.1 ZEN脱毒菌株的研究

3.1.1 特定菌株细胞壁对ZEN的吸附

某些益生菌细胞壁中的特殊结构使它们能够吸附ZEN,进而减少动物对ZEN的暴露与吸收，降低ZEN的积累，从而达到所需的解毒效果。例如，细胞壁含有的碳水化合物(肽聚糖、甘露糖、葡聚糖)、蛋白质和脂类可能通过呈现不同的吸附中心，涉及到不一样的吸附机制，例如氢键、离子相互作用或疏水相互作用[28]。研究结果表明，酵母菌属(Saccharomyces)是相对稳定的霉菌毒素吸附剂，负责吸附的主体是细胞壁中的功能性碳水化合物——葡甘聚糖聚合物。有学者评估了酿酒酵母(S. cerevisiae)将ZEN与细胞壁结合能力的强弱，发现胞径/胞壁厚度的关系表明胞壁表面积与ZEN去除能力之间存在相关性[29],证明了物理吸附是导致酿酒酵母对ZEN脱毒的主要机理。还有研究发现乳酸菌(LAB)菌株不仅可以很好地吸附ZEN,还可以降解ZEN,在具有高酯酶活性的乳酸菌菌株中，菌株对ZEN的降解主要取决于上清液中酯酶的活性[30]。

一些乳杆菌属(Lactobacillus)菌株对ZEN的吸附能力也得到了证实。Murphy等[31]将2 μg/mL的ZEN与鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)共孵育，发现38%～46%的ZEN从细菌颗粒中回收。通过对细胞壁进行加热和酸处理，进一步发现细胞壁的厚度与ZEN的吸附率呈现正相关。同时，植物乳杆菌(L. plantarum)也被证实在ZEN吸附方面有巨大潜力[32]。另外，一些芽胞杆菌属(Bacillus)菌株也有能力吸附ZEN[33]。在ZEN解毒方面，可以发现几乎所有芽胞杆菌都有一定的吸附能力，然而与其分泌酶引起的降解作用相比，菌株的吸附作用要小得多，所以大多数研究都将重点放在研究和开发其降解酶技术上。此外﹐郑文秀等[34]通过驯化酪丁酸梭菌(Clostridium tybutyricum),发现经酸处理后的驯化菌株对ZEN的吸附效果最好，吸附率可达98.5%。在ZEN吸附方面，酿酒酵母细胞壁提取物和活细胞已成为ZEN脱毒研究的重点。

3.1.2 菌株对ZEN的降解

微生物对ZEN的降解主要是通过筛选具备高降解率和高耐受能力的微生物，从而将ZEN分解破坏变成低毒或无毒的产物。Zhang等[35]从135份赤霉病高发区土壤样品中分离筛选到1株有明显ZEN降解效果的解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens),其6 h内降解效率高达95%。黄哲等[36]在以ZEN作为唯一碳源的培养基中富集培养受真菌毒素污染的玉米中的微生物，最终筛选出了2株对ZEN具有良好降解能力的芽胞杆菌，对ZEN降解率分别为54.90%和60.08%。2020年Mlgpa等[37]评估了11种芽胞杆菌菌株对ZEN的影响，评估结果表明，所有试验菌株对ZEN均具有一定的降解能力，各菌株72 h内对ZEN的降解率在58%～96%,并指出主要的降解机理可能在于内酯环的断裂。陈禹竹等[38]在盐角草根际土壤中筛选出1株初步鉴定为斯塔普氏菌属(Stappia)潜在新种(GenBank ID:MT196321)的试验菌株，发现该菌在优化后的最适生长条件下培养144 h后，对初始浓度为10 mg/L的ZEN降解率达92.56%。此外，一些丝状真菌也具有降解ZEN的能力，例如根霉(Rhizopus)[39]、米曲霉(Aspergillus oryzae)[40]、黑曲霉(Aspergillus niger)[41]等。可用于ZEN脱毒的非致病微生物见表3。

表3 可用于ZEN解毒的非致病微生物

除单一菌种外，已有研究报道在发霉玉米芯和玉米秆的农业堆肥中鉴定出了可降解ZEN及其同源物的微生物菌群NZDC-6[33],证实了微生物菌群能通过菌株间的协同效应实现对ZEN的降解。在利用菌株对ZEN的降解时，选用非致病性微生物及微生物菌群对ZEN进行脱毒仍是研究的主要方向，能更好地与实际生产相结合，具有广阔应用前景。

3.2 ZEN降解酶的研究

酶可以催化大量生物和化学反应，是一种高效性和专一性的生物催化剂，且对环境友好无害。目前围绕ZEN降解酶的应用思路主要是利用内酯酶(lactonase)或漆酶(laccase)破坏ZEN的内酯结构，并辅以C6′酮基和酚羟基(C2/C4-OH)的氧化或修饰[49]来实现ZEN的降解(见图1)。

图1 ZEN结构简式及其酶解基团   

因ZEN内酯环上的酯基容易被酯酶或酸碱水解后开环，利用水解酶破坏内酯键结构从而实现ZEN降解是一条可行的脱毒路径。脱毒机理明确、降解活性较高、反应无需介质等优势使人们对内酯水解酶进行了大量的研究。Takahashi等[50]分离纯化粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)中分解ZEN的内酯水解酶，发现该酶可将ZEN完全转化为无任何雌激素活性的代谢产物，然后克隆编码基因，将其命名为ZHD101。之后通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因与ZHD101成功融合，发现与改造前的ZHD101相比，在大肠杆菌中进行表达后的重组蛋白质(EGFP:ZHD101)降解效果与之相接近。Peng等[51]为了进一步了解ZHD酶的结构，分析了ZHD101的晶体结构以及活性中心，发现它的活性中心是由催化核心结构域和α-螺旋帽结构域组成的。为了提高内酯水解酶ZHD101降解α-ZOL的效率，Ke等[52]将ZEN内酯酶由ZENC基因编码后在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达，然后在DDGS、玉米副产物和玉米麸皮中添加纯化的ZENC酶验证其在实际应用中的脱毒能力，发现ZEN的浓度分别降低了71%、89%和95%。

ZEN中的酚羟基(C2/C4-OH)很容易被各种氧化剂氧化。据报道，根霉可以催化ZEN在C4-OH基上的糖基化反应，产生新的代谢产物——ZEN-4-β-D-吡喃葡萄糖苷[39]。米曲霉可以催化ZEN在C4-OH基上进行硫酸盐化，形成ZEN的硫酸盐代谢物，即ZEN-4-硫酸盐，米根霉(R. oryzae)和少孢根霉(R. oligosporus)可以分别将ZEN转化为ZEN-4-葡萄糖苷和ZEN-2-葡萄糖苷[40]。

从粉红粘帚霉MA918中鉴定出一种高效降解ZEN的内酰胺酶(lactamase)——ZENG,对ZEN及其有毒衍生物α-ZOL和α-ZAL均表现出较高的降解能力[53]。为满足工业需求，对蛋白质的催化区域进行突变来提高ZENG的热稳定性，设计了3个位于ZENG催化结构域之间的双位点突变体H134L/S136L、H134F/S136F和H134I/S134I。与野生型相比，H134L/S136L和H134F/S136F的热稳定性均有显著提高。Wang等[54]研究表明，枯草芽胞杆菌的漆酶CotA与化合物结合可以降解黄曲霉毒素B1(AFB1)和ZEN,其分离鉴定的漆酶可通过氧化ZEN分子C2和C4位的双酚结构来实现ZEN降解。Yu等[55]从细菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)SM04中将起降解效果的活性物质分离纯化后得到2种酶，后分别被鉴定为过氧化物酶Prx和氧化酶Oxa, 分析发现ZEN经这2种酶降解后的代谢产物毒性均有所降低，实现了ZEN的有效降解。还有研究报道，来自不同木质纤维素降解真菌的8种锰过氧化物酶，以丙二酸作为介体存在时可以降解90.2%～94.3%的ZEN[56]。此外，有研究人员发现，过氧化物酶可通过氧化断裂ZEN分子中的二酚羟基苯环结构从而实现脱毒效果[57],该酶目前已经在大肠杆菌(Escherichia coli)、毕赤酵母和酿酒酵母中成功表达。目前，过氧化物酶在对ZEN的脱毒过程中需要过氧化氢参与才能实现ZEN脱毒[58]。Azam等[59]研究并报道了一种内酯水解酶和羧肽酶的融合酶ZHDCP,具有同时降解ZEN和赭曲霉毒素A(OTA)的能力。

综上可以发现，ZEN生物转化的可能途径涉及到内酯环的水解、酮基的还原、酚羟基的修饰和二酚苯环的裂解。此外，可通过将不同的特异性霉菌毒素降解酶进行融合，实现解决霉菌毒素共污染问题。新的特异性酶的挖掘不但能丰富霉菌毒素降解酶的种类，也可为新型降解酶的挖掘与应用提供思路。

4、总结与展望

基于ZEN污染的全球性及其在畜产品中的残留造成的健康隐患，开发高效、无污染的ZEN脱毒技术是饲料业和畜牧业的迫切要求。饲料企业可以根据各类原料污染的不同特点，制定相应防霉工作重点，在提高对饲料质量把控的同时要采取能够高效、低成本地脱除饲料中的ZEN的方法。

生物降解法被认为是未来霉菌毒素脱毒技术的主流方向。目前，有多种具有ZEN脱毒或减毒能力的微生物和酶被逐渐鉴定和挖掘，有相当一部分益生菌在作为饲料添加剂方面有可观的应用前景。因此，利用非致病微生物进行ZEN降解，开发高效的降解酶，是解决ZEN污染问题的重要手段。然而，已筛选到的ZEN降解酶大部分尚未实现产业化应用。此外，提高脱毒微生物对实际应用环境的适应能力，合理评估脱毒微生物添加后对饲料品质的影响，都是不容忽视的问题。

减少真菌污染对于从原料上消除真菌毒素而言是最理想的方法。通过基因工程等遗传手段将脱毒基因转入受害农作物进行基因修饰，产生去毒蛋白，同步消除真菌污染和真菌毒素的危害也已取得了一定程度的成功，但从效率和效益角度出发并考虑到转基因作物的潜在负面影响，对于其应用还需要进行长期和深入的评估和研究。

未来，持续探寻性质更优越的ZEN降解菌，提高相应ZEN降解酶稳定性，完善关键降解酶的脱毒效果及评价体系，通过分子改造异源表达ZEN降解酶基因，这些方面仍是该领域研究的重点和趋势。到目前为止，ZEN降解酶在益生菌中表达一直是其在ZEN脱毒(最终目的是确保动物和人类食品安全)研究中的主要焦点。此外，挖掘具有饲料工业应用潜力的微生物或微生物菌群，深入研究其降解途径，可为ZEN的生物降解提供可行的技术产品和工艺，能够促进ZEN降解菌或酶的商业应用，开发更广阔的饲料资源。

参考文献:

[1]武亭亭,杨丹.粮食加工品中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素污染情况调查[J].食品安全质量检测学报,2019,10(12):3674-3678.

[2]单晓雪,马志,唐颜苹,等.超导体包被免疫荧光试纸法同时测定玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮适用性研究[J].粮油食品科技,2023,31(1):143-149.

[3]石楠.芽胞杆菌及酵母菌体外发酵对饲草料中常见霉菌毒素脱毒效果研究[D].银川:宁夏大学,2022.

[4]何雨朔,李萌萌,刘远晓,等.玉米赤霉烯酮及其衍生物的毒性和转化研究进展[J/OL].食品科学,1-13.[2023-04-06].

[5]李孟聪,丁燕玲,谭磊,等.2020年广东省动物饲料中4种主要霉菌毒素污染调查[J].畜牧与兽医,2021,53(5):122-126.

[7]刘亮,苏晓彤,李慧贤,等.玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及m6A甲基化修饰相关基因表达的影响[J].南京农业大学学报,2023,46(4):772-779.

[8]宁春妹,安佳秀,赵颖,等.玉米赤霉烯酮对动物繁殖性能的毒性作用及其机制[J/OL].动物营养学报,[2023-05-04].

[9]邓桃,袁青松,周涛,等.中药材中玉米赤霉烯酮毒素污染现状及其脱毒研究进展[J].安徽农业科学,2022,50(16):5-9.

[11]彭逸.小麦籽粒毒素测定方法的建立及其累积规律分析[D].合肥:安徽农业大学,2021.

[12]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中真菌毒素限量:GB 2761—2017[S].北京:中国标准出版社,2017.

[13]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.饲料卫生标准:GB 13078—2017[S].北京:中国标准出版社,2017.

[14]闫兆凤,黄常刚,杨欣.中国主粮中真菌毒素污染现状[J].卫生研究,2022,51(4):685-691.

[15]黄志伟,刘利晓,李洪波,等.2016—2018年12种植物性饲料原料中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素污染调查分析[J].粮食与饲料工业,2020(2):48-51.

[16]郭萍,薛生辉,谢恺,等.福建省市售食品玉米赤霉烯酮污染状况与暴露评估[J].海峡预防医学杂志,2020,26(4):80-82.

基金资助:河南省重点攻关项目(212102110157);河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(212102110174);

文章来源:薛琳琳,张朋振,杨小进等.玉米赤霉烯酮在玉米及其副产物中污染现状及生物脱毒研究进展[J].畜牧与兽医,2024,56(01):145-151.