有研究证实，高原物种适应低氧环境的机制除了与细胞代谢活动有关外，也与脑红蛋白(neuroglobulin, NGB)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)等多种低氧适应基因相关联[1,2,3,4,5,6]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是1982年Barde等[7]在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质，是动物体内分布最广、含量最多的神经营养因子，主要由脑组织合成并广泛分布于中枢神经系统，在中枢神经系统中发挥着极其重要的作用。目前，关于BDNF的研究大多集中于奶牛生殖系统和脂肪组织[8],以及山羊和实验动物等的中枢神经系统[9,10,11],而在高原牦牛脑组织中的表达分布及其作用机制的研究报道较少。

牦牛是一种能够在其他牛种难以存活的高寒低氧环境下生存和繁衍的物种，其端脑是中枢神经系统的主要组成部分，对环境氧最敏感。本研究将牦牛端脑作为研究对象，以黄牛为对照，观察BDNF表达量和分布规律，旨在揭示高原牦牛和平原黄牛端脑中BDNF表达差异，探讨牦牛脑组织低氧适应性与BDNF表达的关联，为进一步研究牦牛高原低氧适应性机制积累数据。

一、材料和方法

1. 材料

1.1 实验动物及组织样本：

选取来自甘肃省甘南藏族自治州合作市和河南省郑州市定点屠宰场屠宰的健康成年牦牛和黄牛各5头，快速采集端脑组织，依据端脑的分区[12],切分出额叶皮质、颞叶皮质、顶叶皮质、枕叶皮质、大脑白质和海马。一部分组织液氮保存后运回实验室，置于-80 ℃冰箱中保存用于定量检测实验；一部分置于4%多聚甲醛固定液中固定>24 h用于定位实验。

1.2 主要试剂与耗材：

Real-time PCR试剂及耗材：AG RNAex Pro RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),Evo M-MLV 反转录试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司),SYBR Green Pro Taq HS预混型Real-time PCR试剂盒[金斯生物科技(北京)有限公司],罗氏LightCycler96 Real-time PCR仪，高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司),超微量分光光度计(北京凯奥科技发展有限公司),超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械有限公司)。

Western blotting试剂及耗材：兔抗BDNF多克隆抗体、RIPA组织/细胞快速裂解液、彩虹 245 广谱蛋白分子量标准(11～245 kD)、ECL增强型化学发光超敏发光液、4×蛋白上样 buffer(含DTT)均购自北京索莱宝科技有限公司，HRP结合山羊抗兔 IgG、兔抗β肌动蛋白 (β-actin)多克隆抗体均购自北京博奥森生物科技有限公司，冷冻型高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技有限公司)。

免疫组织化学试剂及耗材：兔SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),兔抗 BDNF 多克隆抗体购自北京索莱宝科技有限公司，DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

2. 方法

2.1 Real-time PCR定量检测：

严格按照Trizol法步骤进行端脑脑组织样品总RNA提取，使用超微量分光光度计测定所提取RNA的吸光度(absorbance, A) 的A260/A280值。按照Evo M-MLV反转录试剂盒说明书对RNA 进行反转录从而制备模板cDNA。依据NCBI已收录的牦牛与黄牛BDNF (均为GenBank No. NM_001046607.2)、牦牛与黄牛内参基因β-actin(GenBank No.NM_173979.3、 AY141970.1)序列，使用Primer Premier 5.0进行引物设计，并送往生工生物上海有限公司合成(引物信息见表1)。使用罗氏LightCycler96 Real-time PCR仪进行Real-time PCR实验，反应体系 20 μl: 2×NovoStart SYBR High-Sensitivy Real-time PCR SuperMix 10 μl, 0.2 mmol/L的上游和下游引物各1.0 μl, 模板cDNA 1.0 μl, ddH2O 7.0 μl。反应参数：50 ℃预热 2 min; 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性20 s, 60 ℃退火45 s, 共40个循环。每个样品重复3次，结果取平均值，采用2-ΔΔCt定量分析法计算BDNF mRNA在牦牛和黄牛端脑不同区域的相对表达量。

表1 Real-time PCR引物信息

2.2 Western blotting检测：

准确称取牦牛与黄牛端脑6个分区组织各样本约0.20 g; 滴加1 ml RIPA 组织/细胞快速裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1), 经冷冻型高通量组织研磨器研磨处理后，置于摇床上冰浴2 h; 高速冷冻离心机 12 000 r/min离心15 min后吸取上清；取90 μl蛋白样品加入30 μl 4×蛋白上样buffer, 95 ℃金属浴10 min 变性，-20 ℃冰箱中备用。端脑各分区蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，根据蛋白分子量大小(BDNF:28 kD、β-actin: 42 kD)经电转液转印至PVDF 膜上；5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h; 加入BDNF (1∶1000)、β-actin (1∶3000) 一抗，4 ℃冰箱中过夜；次日用PBST缓冲液摇床充分清洗1 h; 加入二抗(1∶5000),室温摇床孵育2 h, 用PBST缓冲液摇床清洗1.5 h; 增强型化学发光超敏发光液覆盖PVDF膜，置于FUSION FX.EDGE化学发光仪中摄片。各分区蛋白样品重复 3次。 使用Image J-v1.8.0软件测定条带灰度值，分析BDNF蛋白的表达。

2.3 免疫组织化学染色定位：

采用免疫组织化学SP法进行染色：制作石蜡切片，梯度乙醇脱水；枸橼酸钠缓冲液高压抗原修复；滴加试剂1,37 ℃孵育 15 min, PBS洗5 min×3次；滴加试剂 2,37 ℃孵育15 min, 勿洗；滴加一抗(1∶300,阴性对照以PBS替代一抗)完全覆盖组织，4 ℃冰箱过夜；PBS洗5 min×3次(阳性、阴性分开洗);滴加试剂3,37 ℃孵育15 min, PBS洗5 min×3次；滴加试剂4,室温孵育 15 min, PBS洗5 min×3次；滴加配制DAB显色液(A液∶B 液∶HRP=1∶1∶20);常规脱水、透明、封片；使用光学显微镜观察并摄片。

2.4 数据统计学分析：

用Excel 2016软件整理实验数据，并通过SPSS 26.0统计学软件对BDNF mRNA与蛋白的相对表达结果进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05 为差异有显著性，P>0.05为差异性不显著。实验数据均以均值±标准差表示，用 GraphPad Prism 8.0 软件绘图。

二、结果

1. BDNF mRNA在牦牛与黄牛端脑不同区域的表达

超微量分光光度计测定所提取牦牛与黄牛端脑不同区域总RNA的A260/A280值均在1.8～2.0之间，达到Real-time PCR实验所需标准。以 β-actin 为内参基因，对牦牛与黄牛端脑不同区域中BDNF mRNA的表达量进行分析，结果如图1所示，BDNF mRNA在牦牛端脑各区域均有不同程度的表达，其中在颞叶皮质中的表达量最高，海马次之，且两者的表达量均显著高于其他区域(P<0.05),其余组织表达量从高到低依序为顶叶皮质、枕叶皮质和额叶皮质，在大脑白质中的表达量最低，额叶皮质和大脑白质中mRNA含量均显著低于顶叶皮质和枕叶皮质(P<0.05),顶叶皮质和枕叶皮质之间差异性不显著(P>0.05,图1A)。BDNF mRNA在黄牛端脑各区域亦有不同程度的表达，其中在颞叶皮质中的表达量最高，海马中次之，且两者的表达量均显著高于其他区域(P<0.05),其余组织表达量从高到低依次为顶叶皮质、枕叶皮质和额叶皮质，在大脑白质中的表达量最低；BDNF mRNA表达量在顶叶皮质和枕叶皮质之间差异性不显著(P>0.05),但两者的表达量均显著高于额叶皮质和大脑白质(P<0.05, 图1B)。此外，牦牛与黄牛相比较，BDNF mRNA 的表达量在枕叶皮质中牦牛表达量较黄牛低，且两者差异性不显著(P>0.05);其余区域牦牛的表达量都高于黄牛，其中在额叶皮质、颞叶皮质和海马中的表达量存在显著性差异(P<0.05),在顶叶皮质和大脑白质中表达量差异不显著(P>0.05, 图1C)。

2. BDNF蛋白在牦牛与黄牛端脑不同区域的表达

Western blotting检测牦牛与黄牛端脑不同区域中BDNF蛋白的相对表达量，结果如图2所示。牦牛端脑的6个区域中均可检测到BDNF蛋白的表达；其中BDNF蛋白在颞叶皮质中含量最高，海马次之，且均显著高于其他组织(P<0.05);其他组织含量由高到低依次为顶叶皮质、额叶皮质和大脑白质，枕叶皮质中含量最低，且以上各组织间蛋白含量差异性显著(P<0.05,图2A)。BDNF蛋白在黄牛端脑不同分区中也有不同程度的表达；其中BDNF蛋白在黄牛端脑的颞叶皮质中含量最高，海马次之，两者的蛋白含量均显著高于其他组织(P<0.05);顶叶皮质和枕叶皮质之间蛋白含量的差异性不显著(P>0.05),其蛋白含量均显著高于额叶皮质和大脑白质(P<0.05),在大脑白质中蛋白含量最低(图2B)。此外，牦牛与黄牛对比，BDNF蛋白在牦牛枕叶皮质中的表达量低于黄牛，且两者差异存在显著性(P<0.05);其余区域牦牛的表达量都高于黄牛，其中在额叶皮质、颞叶皮质和海马中的表达量差异存在显著性(P<0.05),在顶叶皮质和大脑白质中表达量差异性不显著(P> 0.05,图2C)。

图1 BDNF mRNA在牦牛与黄牛端脑不同区域的表达结果   

图2 BDNF蛋白在牦牛与黄牛端脑不同区域的表达结果   

图3 BDNF蛋白在牦牛和黄牛端脑不同区域 HE 及免疫组织化学染色结果 标尺示50μm  

3.BDNF蛋白在牦牛与黄牛端脑不同区域的分布

牦牛与黄牛端脑各区域组织经HE 染色进行形态学观察，结果显示，端脑皮质各区域中分布着较多的颗粒细胞和神经胶质细胞，以及数量较少的马丁诺提细胞；端脑的白质区主要由神经纤维和神经胶质细胞等构成；海马区有3层细胞形态存在，由内及外依次为由多型细胞组成多形细胞层、锥体细胞组成的锥形细胞层以及颗粒细胞组成分子层。牦牛与黄牛端脑相同区域的组织形态结构不存在明显的差异(图3A1～3A6)。

以HE 染色图片(图3A1～3A6)为对照，免疫组织化学结果显示，BDNF蛋白在牦牛和黄牛端脑的皮质区和白质区以及海马等组织中均有分布且定位趋势基本一致(图3B1～3B6,3C1～3C6),阴性对照中均未见明显阳性表达(图3D1～3D6)。具体如下：在皮质区的额叶皮质、颞叶皮质、顶叶皮质和枕叶皮质中，BDNF蛋白主要集中分布在颗粒细胞和神经胶质细胞，在血管管壁、马丁诺提细胞胞质中和其他细胞中也有少量分布或者不分布(图3B1～3B4,3C1～3C4); 在白质区，BDNF 蛋白在神经胶质细胞和血管管壁中亦有少量分布(图3B5,3C5);在海马组织中，阳性表达在3层细胞形态均有分布，其中在锥体细胞层和多形细胞层大量分布，在分子层和血管管壁中也有少量分布(图3B6,3C6)。

三、讨论

端脑被认为是脑组织中高度发达的区域，不同脑叶或功能区具有不同的功能，它们相互协同来完成高级神经活动，而皮质功能障碍会引起诸多综合征。BDNF在脊椎动物脑组织中高水平表达，其生物学功能主要与酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B, TrkB)和p75神经营养素受体(p75 neurotrophic factor receptor, P75NTR)两种受体有关，它们经相互作用来调控不同的信号通路，从而促进中枢神经系统发育过程中神经细胞的生长、发育、存活、分化和功能表达以及维持神经元的正常功能[13]。有研究发现，低氧训练在提高肥胖大鼠大脑皮质BDNF和TrkB mRNA的表达上较常氧训练更具优势[14,15]。周跃辉[16]通过ELISA和Real-time PCR检测大鼠大脑皮质细胞中VEGF和BDNF蛋白和mRNA的表达情况，最终发现，低氧可诱导大鼠大脑皮层细胞表达VEGF与BDNF,且主要来源于神经元和星形胶质细胞。许险艳等[17]发现，豚鼠脑缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/RI)可导致耳蜗螺旋神经节细胞损伤和BDNF表达量的改变，提示BDNF可能参与了脑I/RI引发的螺旋神经节细胞损伤的病理过程。以上研究均表明，在缺血低氧条件下，BDNF在端脑皮质区的表达水平高于常氧中的表达量，这与本研究发现BDNF在牦牛端脑的额叶皮质、颞叶皮质、顶叶皮质和枕叶皮质中的表达量较黄牛高的结果基本一致。同时，有研究发现，BDNF对皮层神经元细胞具有保护作用，主要通过调节P75NTR和TrkB受体之间的比例，上调ERK与下调JNK蛋白的表达来抑制凋亡和增加细胞的存活[18]。孙小妹等[19]研究证明，加入BDNF可引起磷酸化ERK1/2和磷酸化Akt表达较单纯缺氧组对比具有增强趋势，而磷酸化的p38 MAPK在两组均未见明显表达，提示，BDNF引起磷酸化ERK1/2及磷酸化Akt表达的上调可能是BDNF发挥对缺氧神经元保护作用的机制之一。

尹宏等[20]对平原组和急性高原组大鼠海马中BDNF的表达进行研究发现，急性高原组大鼠海马CA1和CA3区神经元BDNF的阳性表达发生明显变化且含量升高，这与本研究发现BDNF在高原牦牛海马区的表达量显著高于平原黄牛一致，提示BDNF在避免高原低氧对大鼠海马区神经元应激损伤中可能发挥了重要作用。刘小艳[21]针对脑缺血后大鼠海马区神经元BDNF和多种mRNA转录本的表达进行实验，结果发现，缺血模型组大鼠海马CA1区和CA3区不同的BDNF mRNA转录本表达量较假手术组呈不同程度的增加趋势，提示BDNF蛋白表达量改变可能与不同的BDNF mRNA转录本改变有关。同时，将正常大鼠长期暴露于应激状态下，海马区神经元的树突明显萎缩，海马体积也缩小。现已清楚，BDNF是端脑处于应激过程中的关键蛋白，可以调节端脑的可塑性[22]。兴奋性谷氨酸毒性作用导致Ca2+失衡及高水平鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)引起海马神经元能量代谢紊乱，这可能是海马神经元损伤的原因。应激可以引起海马神经元谷氨酸释放升高，而高原低氧应激在牦牛海马中的发生及发展，可能会导致BDNF基因及其表达的改变，从而使海马中BDNF表达量出现上调趋势。

有研究发现，BDNF在感染李斯特菌山羊端脑的内颗粒层星形胶质细胞，内锥体层大、中型锥体细胞，多形细胞层的梭形细胞、小型锥形细胞，分子层及外颗粒层呈阳性表达[10]。李力燕等[23]在猴脑中研究发现，BDNF阳性反应产物主要分布于端脑皮层Ⅲ～Ⅴ层的锥体细胞及突起，在大、小脑的白质也可见到部分BDNF阳性神经胶质细胞，以及在海马的4个区中均可见BDNF表达呈中等强度的中、小阳性锥体细胞。宁晓霞等[24]发现，BDNF在大鼠海马区的阳性表达主要分布于CA1区的锥体细胞层。以上研究结果与本研究发现的BDNF蛋白在牦牛与黄牛的端脑皮质区的颗粒细胞和神经胶质细胞，白质区的神经胶质细胞，以及海马的锥体细胞层和多形细胞层中的阳性表达情况基本一致。

BDNF mRNA和蛋白在牦牛和黄牛端脑不同区域中均有表达，但表达量存在差异，一方面可能与其DNA在转录为mRNA和翻译为蛋白的过程中存在一定的误差有关，另一方面推测与端脑不同分区的特定功能密切相关。牦牛端脑中的表达水平除枕叶皮质外，均高于黄牛，推测与其生存的高原低氧环境有关，BDNF在动物机体适应低氧环境过程中可能发挥着增强低氧耐受性和保护机体内环境稳态等重要功能，其具体机制仍待进一步探讨。

基金资助:国家自然科学基金(31760305);甘肃农业大学科技创新基金-青年导师扶持基金(GAU-QDFC-2021-03);

文章来源:郑丽平,刘霞,杜晓华等.脑源性神经营养因子在牦牛与黄牛端脑不同区域的表达与分布[J].解剖学报,2024,55(01):10-16.