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对牛源性成分鉴定的特异性SSR标记的筛选

2023-12-29 51 上传者：管理员

摘要：为鉴别牛源性成分，本研究运用试剂盒提取肌肉组织DNA,运用微卫星DNA技术建立并优化单一PCR体系，对12个位点的牛微卫星引物进行扩增，电泳凝胶成像系统检测到9个位点扩增出清晰条带，3对不稳定。将扩增效率好的微卫星引物筛选出来，并用于不同动物的特异性扩增，筛选出具有特异性的微卫星引物。结果表明，9个位点微卫星在绵羊、山羊、猪、鸡、鸭5种动物基因组DNA上扩增出现明亮清晰的条带，不存在特异性。故而9个位点微卫星引物不是快速可靠的用于食品中牛源性成分快速鉴别的特异性引物，要运用于牛源性成分鉴定的研究，还需扩大引物的筛选。

关键词：
PCR检测
分子鉴定、肉类检验
微卫星DNA
牛源性成分
特异性微卫星标记
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牛肉制品具有独特的风味和丰富的营养，深受广大消费者的欢迎[1]。但牛肉价格较高，一些商家为谋取利益，在牛肉中掺入其他畜禽肉，或用其他肉类代替，以次充好，极大地损害了消费者的正当利益，影响了消费者的身体健康，使市场秩序受到影响[2]。针对食品市场上肉品掺假的问题，消费者只能通过视觉、嗅觉、触觉、味觉等传统方法鉴定肉的外观、气味、色泽、硬度等，但使用香精香料已经可以使其他肉类具有牛肉的感官特征，因此传统的检测方法已经不能满足肉品鉴定的要求[3],所以提出一种快速有效的鉴别方法，对鉴定牛肉真伪意义重大。

目前食监部门常见的肉种类鉴别方法主要有以下几种：感官评估(通过观察肉品的酮体、肌纤维性状、肌肉及脂肪的颜色及硬度，包括触摸硬度及弹性等因素来鉴别)[4]、蛋白质鉴定技术[5]和分子生物学技术等[6]。感官鉴定不够精确，而蛋白质鉴定技术虽然在鉴别生鲜肉类的品种上应用比较成功，但经过深加工后，肉类蛋白质发生变性，导致蛋白质鉴定技术的可靠性变差[7],同时该方法要求操作者具有相当丰富的实际操作经验，且十分耗时。相比之下，从组织中提取的核酸具有较高的热稳定性，对加工后的肉类鉴别较为准确。于是，以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法，就成了学者们研究的热门领域[8]。

随着分子生物学技术的发展，动植物鉴定中大量使用了微卫星DNA。微卫星(Simplesequencerepeat, SSR)又称简单短串联重复序列，简单重复序列，通常由1～6个核苷酸组成，最常见的是二核苷酸重复序列(CA或GT)n, n为重复次数，通常为15～60次[9]。微卫星DNA具有分布广泛，多态性丰富，易于检测，特异性强等特点，是目前最常用的遗传标记之一[10,11]。侯东军等[12]对引物进行了特异性试验、灵敏度试验和人工配制样品的检测，结果表明，该方法可以定性不定量的同时检测出食品中鸭、牛、猪的成分。陈文炳等[13]应用软件设计7对引物，经PCR筛选确定引物HT-1可在8个用于建立河豚PCR检测的供检河豚样品本中全部检出目的DNA片段；该方法的河豚鱼特异性是通过PCR检测河豚鱼与非河豚鱼的比较来验证的。任君安[14]用数字PCR技术定量研究掺假动物源性成分的肉类及其制品。高志强等[15]对模拟混合生鲜牛肉进行双重PCR扩增检测并建立现行模型，证明双重实时荧光PCR可用于牛源性成分含量的测定。金鹭等[16]采用组合RPCR和DDPCR的方法，以DNA拷贝数和样品质量为基础，建立了用于羊肉定量含量的线性关系。经模拟掺杂样品、市售样品等进行检验，可对所检样品中羊肉含量的5%以上进行精确测定。PCR与实时荧光PCR方法，尤其是根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物所建立的方法，已有大量报道，且进入了中国权威的检测技术标准[17]。孙金婷[18]对牛、绵羊、猪、鸭4种动物的特异性标记引物进行筛选，并用筛选出的引物对混合肉进行定量鉴定。史莹莹等[19]以羊线粒体细胞色素B为基因，以实时荧光相对定量法，设计出具有特异性引物的冷鲜羊肉制品中羊肉成分含量定量检测方法。本研究旨在筛选出能灵敏、准确、快速地检测出牛源性成分的微卫星特异性引物，进行PCR扩增，用于牛源性成分的研究，从而保护消费者和合法经营者的合法权益。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

Taq酶、6x loading Buffer、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；琼脂糖，厦门太阳马生物工程有限公司；微卫星引物，武汉天一辉远生物科技有限公司；无水乙醇，成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电泳凝胶成像分析系统(Tanon1600),上海天能科技有限公司；电泳槽(RDY-600A),北京荣阳经典科技有限公司；电热恒温水浴锅(HH-S6),北京科伟永兴仪器有限公司；掌上离心机(HR-220),北京鼎昊源科技有限公司；温度梯度PCR仪(Eppendorf nexus),德国艾本德股份有限公司；高速离心机(TG16K-II),长沙东旺实验仪器有限公司；制冰机(IMS-20),常熟市雪科电器有限公司；漩涡振荡器(QL-861),其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集及处理

从市场采集鸡、鸭、猪、山羊、绵羊、牛的肌肉组织，95%乙醇硬化，低温保存，备用。

1.3.2 DNA提取及PCR扩增

利用试剂盒提取DNA。4℃冰箱中保存备用。PCR扩增体系及条件见表1、表2。

1.3.3 微卫星引物的筛选

本实验从刘博[20]所做的24个微卫星引物中随机抽取11个牛微卫星引物位点，用2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增物质进行检测，通过牛引物PCR扩增牛肌肉组织DNA。目的片段符合的条带根据所查文献引物片段范围进行选取，扩增产物条带无拖尾现象，条带清晰，条带光亮。微卫星位点与反应条件见表3。

表1 PCR扩增体系

表2 PCR扩增条件

表3 牛微卫星引物序列信息

1.3.4 PCR体系优化

为获得最好的扩增产物，保持其他条件不变，选择50℃、52.4℃、54.7℃、57.6℃、60℃、61.3℃、62℃为反应的退火温度对PCR进行优化。

1.3.5 不同肌肉基因组DNA扩增

利用经过筛选的牛微卫星引物，PCR扩增鸡、鸭、猪、山羊、绵羊和牛的肌肉基因组DNA。

2、结果与分析

2.1 DNA的提取及选择

从鸡、鸭、猪、山羊、绵羊和牛的肌肉组织DNA中提取试剂盒，经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，牛样DNA条带较暗，其余5个样本DNA条带清晰光亮且无降解，可供后续微卫星标记使用。

图1 肌肉组织DNA电泳检测

2.2 PCR体系优化

同位点引物在同一系统不同温度条件下进行扩增，结果如图2所示，扩增条带可在50～62℃范围内被检测到，其大小与目的片段相近。但在62℃、61.3℃的温度下，扩增的带子更清晰、明亮。所以扩增时选择62℃为退火温度。

图2 PCR扩增及优化产物电泳检测

2.3 牛肌肉组织DNA扩增

牛肌肉组织DNA在9对牛微卫星引物上扩增产物凝胶电泳检测结果见图3。由图3可以看出，微卫星引物在牛DNA上扩增出清晰且特异性扩增少的条带。其序列和片段大小如表3所示。

2.4 鸡肌肉组织DNA扩增

鸡肌肉组织DNA在9对牛微卫星引物上扩增产物凝胶电泳检测结果见图4。从图4可以看出，鸡源成分的样品在其微卫星位点IDVGA44、CSRM60、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10的引物上都有扩增的条带，而且跑胶条的大小和目的片段的大小差不多；微卫星位点为BM1225,BM1818,CSSM66,不带扩增条带。其序列和片段大小如表3所示。

图3 牛肌肉组织DNA扩增

图4 鸡肌肉组织DNA扩增

2.5 绵羊肌肉组织DNA扩增

绵羊肌肉组织DNA在9对牛微卫星引物上扩增产物凝胶电泳检测结果见图5。从图5可以看出，绵羊源成分的样品在其微卫星位点BM1225、BM1818、INRA026、CSSM66的引物上均有扩增条带，且扩增条带清晰，运行胶条带大小近似目的片段；微卫星的位点为IDVGA44、CSRM60、BM2113、ETH10、BM1224,不带扩增条带。其序列和片段大小如表3所示。

图5 绵羊肌肉组织DNA扩增

2.6 山羊肌肉组织DNA扩增

山羊肌肉组织DNA在9对牛微卫星引物上扩增产物凝胶电泳检测结果见图6。羊源成分的样品在其微卫星位点BM1225、INRA026、CSSM66、IDVGA44、CSRM60、BM2113、ETH10、BM1224的引物上均有扩增条带，且扩增条带清晰，跑胶条带与目的片段大小相近；微卫星位点为BM1818无延长带。且山羊肌肉组织DNA在牛引物上的扩增与绵羊的扩增结果相似。其序列和片段大小及退火温度如表3所示。

图6 山羊肌肉组织DNA扩增

2.7 鸭肌肉组织DNA扩增

鸭肌肉组织DNA在9对牛微卫星引物上扩增产物凝胶电泳检测结果见图7。鸭源成分的样品在其微卫星位点IDVGA44、CSRM60、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10的引物上都有扩增的条带，其运行胶条的大小和目的片段差不多；微卫星位点为BM1225、BM1818、CSSM66,不带扩增条带。其序列和片段大小及退火温度如表3所示。

图7 鸭肌肉组织DNA扩增

2.8 猪肌肉组织DNA扩增

猪肌肉组织DNA在9对牛微卫星引物上扩增产物凝胶电泳检测结果见图8。猪源性成分的样品在其微卫星位点为BM1225、BM2113、INRA026的引物上均有扩增条带，且跑胶条带大小与目的片段大小相近；微卫星位点为IDVGA44、CSRM60、BM1224、ETH10、BM1818、CSSM66无扩增条带。其序列和片段大小如表3所示。

图8 猪肌肉组织DNA扩增

2.9 微卫星标记的选取及结果分析

牛的微卫星标记IDVGA44、CSRM60、BM1225、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10、BM1818、CSSM66的电泳结果统计见表4。9个微卫星标记都出现了目的条带。扩增山羊、绵羊时，其微卫星标记BM1818、BM1225、BM1224、INRA026、CSSM66;鸡鸭在微卫星标记IDVGA44、CSRM60、BM2113、BM1224、INRA026、ETH10上，猪在微卫星标记BM1225、BM2113、INRA026上，也有目的片段大小的条带。表明这些微卫星标记在牛、羊、山羊、猪、鸡、鸭之间有一定的同源性。但9个位点微卫星引物均在其他5种畜禽肉有扩增条带。被淘汰的原因是微卫星标记扩增产品的电泳表现不是很理想。

表4 9个牛微卫星标记检测6种家畜的样品的结果统计表

3、结论

牛的微卫星标记IDVGA44在牛、山羊、鸡、鸭基因组DNA上均扩增出清晰明亮的条带，无法辨别属于那种动物源性，故而被淘汰。同样，位点CSRM60和BM2113在牛、山羊、猪、鸡、鸭基因组DNA上均扩增出清晰明亮的条带；位点BM1225在牛、山羊、猪、绵羊基因组DNA上均扩增出清晰明亮的条带；位点BM1224和ETH10在牛、山羊、鸡、鸭基因组DNA上均扩增出清晰明亮的条带；位点INRA026在6种动物基因组DNA上均扩增出清晰明亮的条带；位点BM1818在牛、绵羊基因组DNA上均扩增出清晰明亮的条带；位点CSSM66在牛、绵羊基因组DNA上均扩增出清晰明亮的条带，且扩增条带大小与目的片段大小相近，引物没有特异性，9个位点微卫星引物都不能明确鉴定动物源性成分，所以被淘汰掉。对牛源成分鉴定不能作为特异性引物的9个位点微卫星引物。应用于鉴定牛源成分的研究，对引物的筛选也有待拓展。

参考文献:

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