CRISPR/Cas9基因编辑技术在为基础研究和应用研究创建新材料方面是一个非常有价值的工具。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术需要Cas9蛋白,与目标DNA序列互补的导向RNA(gRNA)以及在目标序列中存在NGG原间隔子相邻基序(PAM)位点[1,2]。简而言之,CRISPR/Cas9介导的基因组编辑利用20bpgRNA,通过碱基配对将Cas9核酸酶导向靶位点,Cas9切割目标位点以产生双链断裂(DSB),然后在DNA修复过程中引入突变。CRISPR/Cas9基因编辑技术首先应用在人类与动物细胞系中,随后被改造应用于植物(如拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等)基因组的定向编辑研究中,已经开发了几种CRISPR载体用于植物基因组编辑[2,3,4,5,6,7,8,9]。已有研究结果表明,CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术可以成功地在植物物种中产生各种遗传突变并获得了较高的诱导率和可稳定遗传的基因编辑植株[10,11]。

然而随着基因编辑模型数量的增加,如何快速、高效地获得大量具有预期突变的阳性植株并对基因突变进行检测,特别是进行高通量的筛选,制约了基因编辑技术的发展。同时,在商业化应用之前,对某一特定的编辑载体进行评估有利于该载体的广泛推广。此外,在发掘新的Cas9蛋白的过程中也急需一种评估其切割效率的方法。因此,开发一种快速、高效且经济的检测方法显得尤为重要[12]。

目前已经报道了许多用于鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体的方法,如聚合酶链反应(PCR)/限制酶(RE)检测法[13],T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)检测法,Surveyor核酸酶检测法[14],基于高分辨率熔解(HRM)分析检测法[15,16,17]。但这些方法在实践中往往存在耗时多、昂贵或误报率高的问题。目前,广泛采用的是基于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的基因分型检测法,该方法不依赖于异源双链体的形成,并且能可靠地检测靶位点处的突变[18],既可用于鉴定新突变,还可用作常规基因分型。但是,该方法对于检测碱基替换或者单个碱基对突变的灵敏度有限。因此,本研究提出了一种高效评估CRISPR/Cas9编辑载体编辑效率的方法,该方法能在高效检测突变体的情况下,对碱基替换和单个碱基的突变有着更好的检测效果,并且在操作复杂度,准确度,性价比方面均较现有方法有所提升。

1、材料与方法

1.1CRISPR/Cas9载体的构建

在Wang等[19]报道的新型的CRISPR/Cas9编辑载体的基础上,我们对其进行了改造,主要是靶基因的选择和克隆,以及荧光蛋白报告基因的插入。此过程中涉及的引物序列信息如表1所示。

表1引物序列表

斜体部分为保护碱基，下划线部分为酶切位点。

1.1.1克隆报告基因至

CRISPR/Cas9载体以拟南芥基因组DNA为模板,以ZYP11-FP和ZYP11-RP为引物扩增种子特异性表达的At2S3基因启动子,用来驱动mCherry荧光蛋白基因。利用引物ZYP12-FP和ZYP12-RP将酶切位点BamHI和EcoRI克隆到At2S3片段两端,得到的PCR产物为BamHI-EcoRI-At2S3-BamHI。用BamHI分别酶切pFGC-35S-mCherry-NOS和BamHI-EcoRI-At2S3-BamHI,连接2个酶切后片段获得表达载体pFGC-At2S3-mCherry-NOS。再用EcoRI分别酶切pHEE401和pFGC-At2S3-mCherry-NOS,连接酶切后得到的pHEE401和At2S3-mCherry-NOS片段,获得pHEE401-At2S3-mCherry-NOS质粒载体。

1.1.2sgRNA靶位点选择及引物设计

本研究以脂肪酸去饱和酶基因FAD2为基础设计靶序列,运用CRISPR在线设计工具筛选目标基因的靶序列。并对选择的靶序列作脱靶情况的分析(http://www.rgenome.net/cas-offinder/),最终从拟南芥FAD2基因中选取了G+C含量较高、基因特异性较强的2个关键片段FAD2-1(Target1:5′-TCGCACGGCACACGCTTTG-3′)、FAD2-2(Target2:5′-GTTTGTCCTCGGGTGGCCC-3′)作为靶序列。

1.1.3sgRNA表达盒的获取

以pCBC-DT1T2载体为模板进行四引物扩增,ZYP7用来克隆FAD2靶序列[12],在sgRNA片段两端分别克隆一个靶序列和BsaI酶切位点序列,从而得到具有2个FAD2靶序列的sgRNA表达盒,进行琼脂糖电泳检测并割胶回收目的片段。

1.1.4重组载体的构建

将sgRNA的PCR产物和pHEE401-At2S3-mCherry-NOS载体分别用BsaI酶切后进行连接,成功构建重组载体,构建好的载体具有2个sgRNA表达盒和1个Cas9蛋白基因,筛选标记为潮霉素抗性基因和荧光蛋白基因mCherry(图1)。

图1用于快速检测CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑效率的双元载体质粒图谱

RB、LB:T-DNA左右边界;EC1.2p:EC1.2基因的启动子;rbcS-E9t:rbcSE9基因的终止子;2-sgRs:2个sgRNA组成的表达组件;zCas9:玉米密码子优化的Cas9蛋白基因;U6-26p和U6-29p:2个拟南芥U6基因的启动子;U6-26t:U6-26基因的终止子;At2S3p:拟南芥2S3基因的启动子;mCherry:mCherry荧光蛋白基因;NOSt:NOS基因的终止子;Hyg:潮霉素抗性基因。

1.2农杆菌介导的浸花法转化拟南芥

以野生型拟南芥WT(Col-0)为T0代植株,使用农杆菌介导的浸花法将构建好的编辑基因载体转化至拟南芥[20]。

1.3突变体筛选

1.3.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法

在靶序列两端设计引物,使PCR产物为包括靶序列在内约200bp的片段,提取T1代阳性转基因植株叶片的DNA为模板进行PCR。PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃30s,59℃30s,72℃30s,25个循环;72℃延伸10min,最后4℃保温10min。取1.5μlPCR产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1,质量比)检测[21],用200V电压电泳1.5h,0.1%硝酸银溶液染色,最后用扫描仪记录结果。

1.3.2拟南芥种子油脂分析法

称取5mg拟南芥种子放入2ml离心管中用组织研磨仪进行2次破碎(60Hz,60s)。离心10s后加入400μl1mg/ml的十七烷酸甘油三酯(正己烷做溶剂),上下摇匀后再进行破碎(60Hz,60s),室温静置1h后12000g离心10min。吸取200μl上清液转移到12ml玻璃管中,氮吹浓缩至50～100μl。加入2ml含有1%浓硫酸的甲醇溶液,于80℃恒温干式金属浴上反应2h。反应结束后,立即将玻璃管置于冰中冷却,加入2ml0.9%NaCl(质量体积比)溶液和2ml正己烷,拧紧管盖后涡旋混匀,3000g离心6～10min。吸取上清液,转移到新的12ml玻璃管中。在原玻璃管中继续加入2ml正己烷再次萃取,合并2次获得的上清液。氮吹浓缩上清液体积至300μl左右后,转移到安捷伦顶空进样瓶的内插管中,继续氮吹至50μl。然后用气相色谱仪进行检测[22]。

2、结果与分析

2.1拟南芥转基因阳性后代的筛选

将编辑基因载体转化到拟南芥获得T1代种子后,使用体式荧光显微镜筛选转基因阳性种子,筛选结果如图2所示。在蓝色激发光下显示红色荧光的种子表示有mCherry荧光蛋白报告基因转入,即为阳性植株。

图2借助mCherry荧光蛋白报告基因高效筛选拟南芥转基因后代

图A:T1代转基因种子在蓝光激发下的照片;图B:T1代转基因种子在明场中的照片。其中，箭头指示在蓝光激发下能够显示红色荧光的种子，即转基因阳性种子。

2.2CRISPR/Cas9基因编辑效率检测

2.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳法

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对荧光筛选获得的转基因阳性植株进行突变与否的鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(图3)显示,不具有野生型对照条带的为纯合突变植株,既有突变条带又有野生型对照条带的为杂合突变植株,只有野生型对照条带的则为未突变植株。

图3聚丙烯酰胺凝胶电泳图

泳道1、2、3、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、28为未突变株系;泳道4、24、29为检测到的基因组突变株系。M:DNA分子标记;WT:野生型对照。

对鉴定结果进行统计从而确定CRISPR/Cas9系统的编辑效率。如表2所示,4次试验的编辑效率分别为15.4%、9.1%、3.7%、4.0%。

2.2.2脂肪酸组分分析

将T1代对应的T2代种子分别进行脂肪酸组分分析,结果发现FAD2被编辑后其中一个株系(图4B)与野生型(图4A)相比油酸(C18∶1)的相对含量明显增加,亚油酸(C18∶2)与亚麻酸(C18∶3)的相对含量都明显减少,其中C18∶2的相对含量降低了26%。一般野生型拟南芥种子中C18∶1含量大约17%,当C18∶1含量≥30%时判定FDA2位点突变。我们对脂肪酸组分变化达到判定突变标准的株系提取DNA后进行了测序,测序结果表明这些株系确实存在突变。

表2通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测获得的CRISPR/Cas9基因编辑效率

统计分析得出CRISPR/Cas9基因编辑效率如表3所示,4次试验的编辑效率分别为57.7%、54.5%、74.1%、72.0%。

图4拟南芥脂肪酸甲酯的GC分析

图A:野生型WT背景下脂肪酸甲酯气相色谱图，图B:FAD2脂肪酸甲酯气相色谱图。脂肪酸甲酯(FAME)峰值1:十六烷酸甲酯(C16∶0);峰值2:十七烷酸甲酯(C17∶0);峰值3:硬脂酸甲酯(C18∶0);峰值4:油酸甲酯(C18∶1);峰值5:亚油酸甲酯(C18∶2);峰值6:亚麻酸甲酯(C18∶3);峰值7:花生酸甲酯(C20∶0);峰值8:二十碳烯酸甲酯(C20∶1)。图4拟南芥脂肪酸甲酯的GC分析

表3通过脂肪酸组分分析获得的CRISPR/Cas9的编辑效率

2.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳法与脂肪酸组分分析法统计结果比较

通过对T1代转基因阳性植株进行分子鉴定,统计分析后得到CRISPR/Cas9基因编辑效率为3.7%～15.4%,但对T2代种子的脂肪酸组分进行分析,通过脂肪酸组分的变化得到的CRISPR/Cas9编辑效率为54.5%～74.1%。并且,以其中一个株系为例,对其T1代植株进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并未检测出突变(图5A),通过对其T2代种子的脂肪酸组分进行测定后分析发现,C18∶1的含量由16%上升为40%,与野生型相比增加了24个百分点。对该株系的后代分离群体进行测序,测序结果也表明该株系的FAD2基因确实存在突变,且该突变为一个碱基的插入(图5B)。比较2种检测方法所得的结果,我们可以得知通过分析脂肪酸组分变化来检测CRISPR/Cas9基因编辑突变体的方法漏检率更低,结果更准确,方法更具优越性。该方法有效地克服了分子鉴定存在的缺陷,从而能高效地检测CRISPR/Cas9基因编辑技术的编辑效率。

图5突变体聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果与测序检测结果比对

图A:聚丙烯酰胺凝胶电泳图，泳道1、2、3为不同株系的PCR产物，M:DNA分子标记，WT:野生型对照。图B:FAD2突变体测序结果图。图5突变体聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果与测序检测结果比对

3、讨论

CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种高效的基因编辑技术,为基因功能研究和作物改良提供了突变体[23,24,25]。本研究对CRISPR/Cas9基因编辑效率的检测方法进行了优化。将mCherry荧光蛋白报告基因作为选择基因。根据脂肪酸脱氢酶FAD2在拟南芥油脂合成中的作用,选择FAD2基因为靶序列。将构建的载体使用农杆菌转化拟南芥,用荧光筛选获得T1代转基因阳性植株,对阳性植株分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法和T2代的脂肪酸组分分析法对编辑效率进行检测,结果表明通过脂肪酸组分分析的方法可以快速、高效地对基因突变进行检测,特别是高通量的筛选。同时该方法可以对编辑载体进行评估,为载体的商业化应用提供理论基础。此外,该方法也可以为评估新的Cas9蛋白提供一个有效的工具。

Wang等[19]报道了一种新型的CRISPR/Cas9编辑载体,该载体中的Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子驱动,以此可以有效地避免组成型过表达启动子常产生的嵌合型T1代突变体[26]。另外,该载体中2个串联的sgRNA取代了传统的单个sgRNA,从而可以同时对2个甚至多个基因进行编辑,避免了传统的杂交方法获得多突变体过程中的基因连锁和基因渗透现象。

本研究对该编辑载体进行了设计和改造,在标记基因的选择上,用报告基因替代了常用的选择基因,将种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动的mCherry荧光蛋白基因插入在Cas9蛋白基因之后,可以高效筛选T1代转基因阳性植株以及最终获得非转基因的突变后代。荧光蛋白报告基因的插入相比于传统的筛选方法如抗生素筛选具有更高的优越性,它可以克服抗生素筛选不足,比如基因编辑后造成的植株致死或由于抗性较差而不能筛选到阳性植株。而且基于荧光信号筛选,突变体可以从大群体中分离出来,这有助于节省时间和劳动力。最后,前人常使用组成型表达的35S启动子来驱动荧光蛋白的表达,但是往往由此造成荧光蛋白在植物体内广泛表达而影响植物的生长发育,因此,我们在本研究中选用了在种子中专一性表达的At2S3基因启动子来驱动mCherry荧光基因。在靶序列的选择上,将以脂肪酸脱氢酶基因FAD2为基础设计的靶序列插入载体。在拟南芥,脂肪酸脱氢酶fad2是位于内质网的油酸(C18∶1)去饱和酶,负责在油酸中引入第二个双键形成亚油酸(C18∶2)[27]。因此,突变体fad2中C18不饱和脂肪酸的组成均较野生型有极大的区别[28]。最后只要通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成,快速简便地筛选出被编辑的植株,从而确定特定的CRISPR/Cas9基因编辑技术的编辑效率。

我们对T1代转基因阳性植株进行分子鉴定,鉴定结果进行统计分析后得到的CRISPR/Cas9基因编辑效率为3.7%～15.4%。但对T2代种子的脂肪酸组分进行分析,通过脂肪酸组分的变化得到的CRISPR/Cas9基因编辑效率为54.5%～74.1%。由此我们发现,通过分析脂肪酸组分变化来检测CRISPR/Cas9基因编辑突变体的方法漏检率更低,结果更准确,方法更具优越性。该方法有效地克服了分子鉴定存在的缺陷,从而能高效地检测CRISPR/Cas9基因编辑技术的编辑效率。

本研究对鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体的方法进行了改进,与其他方法相比,该方法既不受可用的限制性内切酶酶切位点的限制,也不需要大量的人力物力就可以进行高通量的筛选;而且该方法有效地克服了分子鉴定存在的缺陷,能够有效地筛选出被CRISPR/Cas9基因编辑后1个或2个碱基的缺失、插入或者替换的突变体,从而快速、准确、高效地对CRISPR/Cas9基因编辑效率进行检测并快速筛选突变体。

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基金:科技部转基因重大专项(2016ZX08010003-003).