毛发是一种最常见、易存储、抗污染能力强的生物材料[1,2]，含有多态性蛋白质、激素和DNA等，可以提供动物个体的生物学信息[3,4,5]。其中DNA所能够提供的遗传信息最为丰富，不仅用于物种鉴定，还可用来推断系统发育关系、分析种群遗传结构、追溯个体间的血缘关系等[6,7]。但是这些信息的挖掘潜力受限于DNA的质和量，DNA质量越低实验分析越困难。

毛发与其他组织一样，具有核DNA(nuDNA)和线粒体DNA(mtDNA)。毛干形成后期主要是细胞的角化，这一过程伴随着nuDNA的降解，除了角蛋白合成有关的基因以外，其他的部分逐渐断裂、降解、消失[5]。最后存留的DNA片段很小，而且含量极低。mtDNA的拷贝数是nuDNA的数百倍，且处于细胞质的线粒体中，保存的机会较高[5]。因此，通常情况下，可以从毛干角化组织中获得足够的mtDNA用于PCR扩增[8]，而nuDNA则非常困难。虽然经过大量尝试，对于nuDNA上遗传标记的分析仍然达不到稳定、可靠，除了PCR扩增成功率低以外，还可能出现等位基因缺失和杂峰等问题[9,10,11,12]，因此，人们普遍认为毛干中提取的DNA不能用于核遗传标记的分析。

我们前期研究中发现，造成这种情况的主要原因还是在于提取效率低下。我们改进了提取方法，从毛干中得到的DNA可用于微卫星等核基因的分析(另文报道)，但是无法用于基因组的测序。主要原因是毛干DNA中混有大量的细菌DNA，其数量远远超过动物DNA。这些细菌DNA主要来自毛发表面和经断裂处进入髓质的环境细菌。只要有效去除细菌DNA，有效富集动物DNA，就可以在高通量测序中获得足够的动物序列。

去除细菌DNA可以有两种途径:一是把毛发在提取DNA之前彻底清洗，去除细菌;二是在获得DNA之后，把细菌DNA分离出去。第二种途径通常采用甲基化抗体包被的磁珠，特异性地吸附甲基化丰富的动物DNA，而不吸附甲基化缺乏的细菌DNA，从而达到分离目的。但是这一方法一方面费用十分昂贵，另一方面，操作过程涉及多次移液，会损失大量的动物DNA。因此，清除细菌是最为便捷、便宜的途径。目前清洗毛发的方法有很多，一般常用的方法是用加酶洗衣粉溶液浸泡、冲洗毛发，然后以无菌水漂洗，再用70%—75%的酒精浸泡[13]。洗衣粉溶液也可以用日用洗发水溶液替代。但这些方法清除细菌不彻底，黏附于鳞片内侧和进入毛干内部的细菌无法清除。

我们建立了一种清洗毛发的方法，能够高效、快速地去除毛干上的细菌，且对下游DNA的提取影响不大。这种方法采用常规试剂和仪器，成本低廉，便于推广应用。

1、材料与方法

1.1 毛发样品及其预处理

实验前将所有的剪刀、刀片、镊子、玻璃器皿等先清洗干净，用高压灭菌锅灭菌，放入烘箱中60℃烘干备用。取1张常温、常湿下保存的蓝狐(北极狐，Vulpeslagopus)生皮，在皮张背部用打毛剪从根部剪取毛发约2g放入烧杯中，加入1%的洗衣粉溶液(雕牌含酶洗衣粉)100mL，用无菌玻璃棒搅拌2min，转移到新的无菌烧杯中，加入无菌去离子水清洗2遍。移入75%的酒精中浸泡10min，放到无菌的培养皿中，超净工作台上将水分自然蒸干(也可以用鼓风式烘箱加速水分蒸发)。用铝箔纸密封，室温保存备用。

1.2 细菌的清洗

用CP513型电子天平(OHAUS，美国)称15份毛发样品，每份7mg，分别移入15个无菌的1.5mL离心管中。本实验使用4种不同的处理方法来处理毛发样本，每种处理方法做3个重复，标记为I(I#1、I#2、I#3)—IV(IV#1、IV#2、IV#3)，最后一组V(V#1、V#2、V#3)作为对照组，清洗之后未加处理。毛干操作步骤如下。

1.2.1 取500μLSDS溶液(10%)和500μLNaOH溶液(4mol/L)加入试管I中，短暂震荡30s，室温放置15min，小心移去液体，加入1000μL无菌去离子水，震荡30s，移去液体，重复漂洗1次，移去液体。把毛干移入新的试管，加入1000μL95%的乙醇保存备用。

1.2.2 取1000μL溶菌酶溶液(30mg/mL)加入试管II中，震荡30s，随后置于37℃水浴锅中水浴45min，移去液体，用1000μL无菌去离子水漂洗2遍，再加入1000μL1%的SDS溶液，置于99℃水浴中孵育15min，取出后移除液体，加入无菌的去离子水漂洗2遍，去除液体。向试管III中加入1000μL1%的tritonX-100[14]，将试管III置于99℃水浴中孵育15min，取出后移除液体，加入无菌的去离子水漂洗2遍，去除液体，移入新管，以95%乙醇浸泡保存备用。

1.2.3 向试管IV中加入1000μL的1.5%SDS溶液，短暂震荡30s，置于65℃水浴中40min，移去液体，随后将毛干放入装有65℃4mol/L的NaOH溶液的试管中，用镊子夹住毛发，上下摆动，20s后，迅速拿出，用去离子水冲洗3遍。移入新管，以95%乙醇浸泡保存备用。

为了进一步验证NaOH溶液处理的有效性，增加两组实验，将处理时间从20s延长到35s和50s，其他处理过程不变，样本分别标记为IV(IV#135、IV#235、IV#335),IV(IV#150、IV#250、IV#350)。

1.3 DNA的提取

在超净工作台内，将毛发样品取出室温下放置5min以上，使乙醇自然挥发。转至1.5mL的无菌离心管内，按原样编号。用剪刀把样品剪碎，每个试管中加入400μLTNE缓冲液(10mmol/LTris-HCL、10mmol/LEDTA、100mmol/LNaCl,pH=8)、45μL蛋白酶K(10mg/mL)、45μLDTT(0.15mol/L)和35μLSDS(10%)，稍微震荡混匀，56℃水浴中消化4h后，再加入30μL10mg/mL的蛋白酶K，继续消化3h，随后使用动植物基因组磁珠法提取试剂盒(中科雷鸣，中国北京)进行提取，具体操作步骤见说明书。

1.4 提取DNA的验证

为了确定提取成功，以蓝狐mtDNA上一个142bp的片段和细菌pDNA上一个187bp的片段为标记，分别进行PCR扩增。pDNA扩增引物Np为F:5'-CAT-GAAGTCGGAATCGCTAGTAATC-3',R:5'-CTACGGC-TACCTTGTTACGACTTC-3';mtDNA片段扩增引物Nmt为F:5'-CACGTCGTATACCAACGCCT-3',R:5'-GG-GTTGTCCTAGGAGTGCAAA-3';2对引物的Tm均为56℃，可采取同样的扩增体系和扩增程序。

扩增反应在10μL体系中进行，PCR反应体系含有2×RapidTaqMasterMix(南京维诺赞生物科技有限公司)5μL，上下游引物(10μmol/L)各0.3μL,DNA模板2μL，去离子水2.4μL。混匀后瞬时离心，用9700型PCR扩增仪(GeneAmp，美国)进行扩增。扩增程序为:95℃预变性3min;95℃变性20s,56℃退火20s,72℃延伸20s,35个循环;循环结束后72℃延伸5min。采用同样的扩增体系和扩增程序。

从2个扩增反应中各取1.5μL的扩增产物进行混合，在1.5%琼脂糖胶进行电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE,100V下电泳22min。

1.5 动物DNA和细菌DNA丰度的变化

为了检测不同处理方法对细菌清除的效果，以动物的mtDNA和细菌的质粒DNA(pDNA)为目标，通过相对荧光定量PCR方法分别测定相对Ct值。mtDNA的扩增引物(Nmt)和pDNA的扩增引物(Np)仍采用前述引物。为了提高扩增的特异性，将Tm都提升到60℃。二者的扩增体系和扩增条件相同。

PCR扩增体系为10μL，包括1μLDNA溶液、5μLTBGreenPremixExTaqII(Takara，大连)，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL和3.2μL去离子水。扩增条件为95℃预变性30s;95℃变性5s,60℃退火34s,72℃延伸30s,40个循环;循环结束后72℃延伸10s。反应用CFX384Real-TimeSystem荧光定量仪(BIO-RAD，美国)完成，在每一个循环延伸步骤结束后立即收集荧光信号并显示结果。

用mtDNA的Ct值(Ctm)与细菌pDNA的Ct值(Ctb)的比值及它们Ct值的变化情况作为衡量细菌清除效果的标准，比值越低，pDNA的Ct值升高的越多，说明细菌的pDNA拷贝数越少，处理效果越好。

2、结果

2.1 DNA提取效果的定性检验

为了验证上述实验中已经成功获得了毛干DNA，以提取的DNA溶液作为模板，扩增蓝狐mtDNA上142bp的片段和细菌pDNA上187bp的片段。如图1，所有的处理都可以同时扩增出2个目的片段，说明这些处理中都成功提取到DNA，但都没有把细菌完全消除干净。泳道5上除了2条目的片段之外，还在下面出现了明显的引物二聚体，而且目的片段的信号强度比前几个泳道有所降低，尤其是细菌pDNA的片段信号衰减相对明显，说明所提取的DNA总量有所减小，细菌DNA的量减少更明显。

2.2 不同处理方法对细菌清除效果的定量检测

引物Nmt和Np的熔解曲线如图2所示，它们的熔点峰值分别为82.5℃和87℃左右，熔解曲线峰值点高度重合，且仅有1个峰值点，说明引物无二聚体，无非特异性扩增及其他外源DNA污染，引物设计完全符合实验要求，保证实验结果的真实性。

图1蓝狐毛干在4种方法处理下mtDNA和细菌pDNA的扩增产物的电泳图

图2引物Np和Nmt的熔解曲线

采用荧光定量PCR检测发现，未经处理的毛干(V#1—V#3样本)中提取的总DNA中，mtDNA与细菌pDNA的Ct值分别是(15.53±0.15)、(16.82±0.03)，其比值为(0.923±0.009)。以这一比值为基准评估不同方法清洗后质粒DNA的数量变化。结果显示，在常温下经过SDS和NaOH双重处理、溶菌酶处理以及TritonX-100处理，I—III样品中mtDNA的Ct值分别为(17.86±0.42)、(16.15±0.48)和(16.23±0.45);pDNA的Ct值为(16.98±0.10)、(17.02±0.18)和(17.14±0.14)。mtDNA与pDNA的Ct值之比均接近对照组的水平，分别为(1.052±0.026)、(0.949±0.037)和(0.947±0.033)。这表明这3种处理方法都未能有效洗脱毛发上的细菌。当把样品在65℃的NaOH中保留20s,mtDNA和pDNA的Ct值分别为(23.653±0.036)和分别为(26.6±0.345)，二者之间的比值为(0.889±0.01),pDNA的Ct值有明显变化，平均提高了(9.8±0.395)，说明这一处理方法使细菌DNA的拷贝数明显下降，而mtDNA的相对比例也有所提高，二者的差异扩大了近10倍。

为了进一步验证NaOH溶液中处理的时间对细菌DNA清除效果的影响，在20s的基础上，分别延长到35s和50s，其他实验步骤不变。结果显示，当处理时间延长到35s时，其中一个样本(IV#135)的mtD-NA和pDNA均无数值显示，另外两组(IV#235,IV#335)的mtDNA的Ct值分别达到25.53和26.45,pDNA的Ct值分别为28.50和30.22，较处理20s相比，分别提升了(2.33±0.42)和(2.85±0.43)，这说明将温度提升到35℃时，此方法对细菌DNA和mtD-NA的影响基本相一致，还可能导致提取失败。当处理时间延长到50s时，在DNA洗脱过程中，磁珠由原来的分散状态转变为凝聚状态，反复震荡也无法分散，使后续步骤无法进行。所以，就目前的方案而言，最佳处理时间为20s左右即可。

图34种处理方法(I—IV)与对照组(V)mtDNA和pDNA的Ct值的比较

3、讨论

由于毛干具有稳定的化学结构、取材便利及易保存等特点[7]，人们将其视为获取动物DNA的重要来源。很多文献报道使用从毛干中提取的DNA做PCR扩增时，实验结果大都不尽人意，尤其是nuDNA扩增的成功率极低。虽然人们从提取方法、扩增条件等方面进行优化，但也难以获得有效提升[9,15]。

本研究首先评估了毛发经过普通清洗后(样本V)，获得的总DNA可以同时扩增出mtDNA和细菌pDNA的目的片段，显示二者同时存在(图1)。荧光定量PCR的检测显示，mtDNA和pDNA的Ct均值分别为(15.53±0.15)和(16.82±0.03)，二者的比值为(0.923±0.009)。说明细菌DNA的数量与动物的mtDNA相差不多。因为nuDNA比mtDNA低至少3个数量级[16]，所以如果细菌DNA在总DNA中占优势，nuDNA的扩增效率就会受到显著影响。因此在DNA提取之前清除细菌是非常必要的。

我们以样本V为基准测试了4种处理方案的效果。方案I中采用去垢剂SDS和NaOH处理，期望通过阴离子表面活性剂和NaOH共同对细菌进行裂解，但是pDNA和mtDNA的拷贝数并未发生差分。方案II中采用溶菌酶来裂解细菌，达到消除的目的。但是虽经长时间的作用(45min)，也没有把pDNA和mtDNA的拷贝数进行有效差分，说明溶菌酶的作用效率不高。方案III中采用了非离子表面活性剂tritonX-100提高体系的浸润性和细菌的洗脱效果，但也没有获得满意的效果。方案IV中采用了热的高浓度NaOH(65℃，4mol/L)短时间作用(20s)，达到了2种DNA的有效差分，pDNA的拷贝数下降了3个数量级而使动物DNA成为优势(图3)。

以上结果说明，第一，细菌对毛干的黏附力很强，采用洗衣粉溶液、阴离子去垢剂和碱液等一般的方法无法彻底清除;第二，细菌的裂解比较困难，溶菌酶等温和条件不能达到满意效果，只有通过热的强碱溶液才能裂解，并从毛干上脱落下来。

然而，延长强碱的处理时间(从20s延长到35s和50s)未能获得更好的效果，相反，还严重影响了DNA提取效率，甚至引发了磁珠的凝聚。推测可能有两个原因，一是在较高温度下延长作用时间之后，强碱破坏了毛干结构并进入毛干，裂解了残存的DNA;二是强碱进入毛干后，在下游的漂洗步骤中不能有效漂洗出来，强碱被带入磁珠捕获步骤，改变了磁珠表面性质，引发凝集。

综上所述，采用热的强碱溶液可以有效清除毛干上的细菌DNA,65℃时最佳处理时间在20s左右。虽然未对温度进行梯度测试，但也不推荐使用65℃以上的高温，避免强碱对毛干和DNA的降解作用过于激烈。另外，本研究仅测试了蓝狐的毛干，包括针毛和绒毛。但是，哺乳动物毛发结构和化学组成大同小异，应该具有普遍意义。而鹿科(Cervidae)动物的毛干属于薄壁中空的结构，承受强碱作用的能力较低，作用时间可能更要缩短，需要另行摸索。

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基金:国家重点研发计划项目(2018YFD0502201).