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淋球菌在高通量全基因组测序应用中耐药研究分析

2020-07-08 800 上传者：管理员

摘要：淋病发病率的快速上升，对一线抗生素的耐药，迄今未能研制出有效的预防淋病感染的疫苗为淋病的防治带来了巨大的挑战。高通量全基因组测序(WGS)技术是追踪耐药菌株起源及传播的有效方法之一，本文主要综述了WGS在淋球菌抗菌耐药性、系统发育基因组学、传播模式以及表观遗传学等方面的应用。

关键词：
基因测序
性传染
抗生素耐药
淋球菌
高通量全基因组测序
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淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae,NG）简称淋球菌，是经典的性传播疾病淋病的病原体。其潜伏期短，能够引起急慢性的生殖道炎症反应，发生并发症时能够导致不孕不育，异位妊娠等后果。目前抗生素治疗是淋病治疗的主要途径，由于抗生素的不合理用药及抗菌耐药性（antimicrobial resistance,AMR）的出现导致了淋球菌广泛耐药、耐多药[1]。为了减缓耐药淋球菌的传播，迫切需要新的方法深入了解其出现和传播的因素。最近的研究表明，全基因组测序（whole-genome sequencing,WGS）分析可能是一种单一的、快速的、具有成本效益的有效控制耐药菌株传播的方法，WGS在定义耐药基因型和预测耐药表型具有很高的敏感性和特异性[2,3]。因此，本文主要综述WGS在研究淋球菌抗菌耐药性、系统基因组学以及传播研究中的应用并基于WGS在转录和表观遗传分析的潜在用途，为控制淋病蔓延提供方向[4]。

1、WGS在研究淋球菌抗菌耐药性的应用

淋球菌耐药菌株及广谱耐药菌株的报道呈现出爆炸性增长，这对全球公共卫生造成了严重的影响，淋球菌耐药已成为全球急需解决的公共卫生难题[5]。AMR毒株的快速鉴定可确保适当和个性化的治疗,并能及时地识别和调查淋病的疫情。WGS是研究AMR决定因素出现和传播的理想方法，可以预测AMR在淋球菌群体中的出现和传播以及AMR菌株在人群中的传播[6]。淋球菌通过自发突变或水平基因转移对抗生素产生耐药性，耐药机制包括抗菌药物失活、抗菌药物靶点改变以及增加抗菌药物的排出和减少对抗菌药物的吸收，因此迫切需要对淋球菌全基因进行研究。测序和生物信息学技术的进步提供了快速和自动化的全基因组序列数据分析，利用WGS了解抗生素耐药性成为抗击AMR的关键。例如，已在几项WGS对淋病耐药性研究中确认，第三代头孢菌素头孢克肟的耐药性与拥有镶嵌式penA等位基因之间存在关联[7,8]。Harrison等[9]利用WGS数据构建了淋球菌AMR关系网络图，该图描述了来自289个分离株的全基因组多位点序列分型，每个分支顶端代表一个分离株，并根据AMR基因型进行了颜色标注，红色代表耐药AMR基因型的分离株，绿色代表易受感染的分离株并对淋球菌遗传岛进行了标注。通过数据分析将该289株菌株分为8个集群，这项研究对常见的抗生素耐药位点如PonA\PorA\PorB\GryA\macA及额外的未知的抗菌耐药性基因通过AMR基因座基因注释，结合多位点序列分型分析，鉴定出了具有不同AMR基因型的分离株簇。该研究结果可结合耐药表型给予临床耐药菌株的治疗，能有效控制淋病耐药菌株的传播。利用更多的WGS数据共享，了解和监测淋球菌获得抗生素耐药性的因素，这对预测和控制AMR菌株在人群中的传播提供可能。

2、WGS在淋球菌系统基因组学的应用

了解淋球菌耐药分离株之间的克隆关系及淋球菌耐药基因的进化是了解淋病耐药传播的重要策略。过去对淋球菌耐药性研究主要集中于一些具有代表性的基因或基因组的遗传区域，以阐明抗生素耐药性的潜在机制。但目前研究表明高水平的重组可能会干扰对淋球菌种群的研究，特别是如果这些研究是基于菌株内相对于整个基因组而言很少的遗传位点，因此,有必要对全球淋球菌种群结构进行全基因组水平的研究[10]。WGS技术的发展，加速了人们对于淋球菌耐药性菌群的遗传结构的研究。Ezewudo等[7]采用了WGS的方法对61株来自美国、加拿大、日本、澳大利亚等多个国家的临床分离株进行测序，结果表明全球淋球菌至少是由5个遗传亚群组成。其中来自不同地理位置的亚种群的单个菌株证实了该病原体的世界性，也表明了人口结构经历了多次快速的国际扩张。该文数据显示亚群3菌株可能是物种内基因交换的纽带，亚群1,2是易对抗生素耐药的分离株。通过对大量不同时间和地理的淋球菌分离株全基因组序列的分析，对于阐明淋球菌物种的进化、多样性以及基因组含量、抗生素耐药性和临床治疗方案至关重要，这是传统的测序方法无法轻易获得的。

3、WGS在淋病传播模式研究中的应用

全基因组测序可以对病原体的传播流行病学进行高精度的研究，其对于具有复杂的高重组率的淋球菌的传播模式的研究至关重要。例如Grad等[11]研究了在美国2009-2010年间通过淋球菌分离株监测项目（GISP）收集的236株淋球菌分离株，利用系统地理学和贝叶斯分析推断了NG分离株在美国的跨越时间、空间和性网络的传播模式，分析结果表明头孢菌素敏感性降低主要是通过男男性行为的性网络传播的。同时Grad等采用全基因组测序的技术分析了各分离株之间的关系，通过构建的性网络模式重建可能的耐药传播。如研究发现对头孢克肟的敏感性降低的主要原因是penA XXXIV等位基因的镶嵌式获得使得头孢克肟耐药性得到广泛传播。分析还发现偶尔进入异性恋网络的男性与男性发生性关系的人群中，淋球菌中的抗生素耐药性传播更容易发生，因此提高对同性恋中耐药传播模式的监测，对控制淋球菌出现的广泛耐药性至关重要。WGS对几种病原体的暴发和传播网络提供了深入了解，其分辨率高于传统分型方法[12]。通过WGS识别淋球菌耐药的基因组流行病学，筛选和跟踪耐药感染的网络传播目标，进而有效地监测及控制传染源，有助于减缓或遏制淋球菌耐药的蔓延[13]。

4、WGS在淋球菌耐药基因表达中的应用和表观遗传分析

近年来随着WGS技术的发展，其应用并不局限于评估核苷酸水平上的分型、相关性和传播的分析，也可以用来检测各种菌株的差异表达和表观遗传特征。RNA-seq是一种利用RNA转录本的高通量测序来确定和量化基因表达水平变化的方法。例如有研究通过该方法预测了827个重要的淋球菌基因，有研究对耐药基因的差异表达进行了研究，如耐药NG株mtrCDE基因表达上调，mtrR表达下调，研究利用少数基因的表达谱预测耐药性。由于传统的方法难以确定淋球菌耐药性的决定因素，WGS的转录组分析可在发现耐药性决定因素方面发挥重要作用。有证据表明AMR是一种多位点现象，可能是不同基因突变共同作用的结果，WGS方法可用于识别具有耐药性的基因中的特定突变，因此RNA-Seq分析结果也可能有助于阐明各种抗性基因之间的相互作用，为淋球菌耐药性机制的阐明提供方向[14]。

表观遗传学是研究非基因序列改变所致基因表达水平变化，这一领域的进展将极大地影响对淋球菌AMR的理解。细菌表观遗传机制的研究大多集中在DNA和RNA甲基化的作用及其对细胞调控、抗生素耐药性的影响。有证据支持DNA和RNA甲基化都对细菌的AMR有影响。例如，DNA甲基化可以导致不同的基因表达，如果这种表达在特定抗生素存在的情况下影响菌株的抗生素敏感性，那么该选择可能有利于耐药表型的进化和传播[15,16]。因此，对AMR淋球菌分离株进行表观基因组分析是十分必要的，因为这些分析的结果可以阐明这种细菌的新型耐药机制。此外，一旦发现表观遗传模式，转录组分析可用于量化已识别基因表达的差异[17]，这有益于预测新的耐药模式，控制AMR菌株的传播。

5、结语

淋病是一个全球性的公共卫生问题，对抗菌药物的高度耐药性加剧了这一问题。WGS为淋病的暴发和流行以及对耐药菌株的进化和变异的控制提供了强有力的工具，WGS技术的引入使淋球菌传播的跟踪和对可用抗生素的耐药性研究成为可能[18]。WGS可根据已知的抗性决定因素，追踪这些决定因素在淋病人群中的传播，并识别出对耐药性有帮助的新位点。与以前使用的分型方法相比，WGS能够对淋病传播在人群之间进行更详细的流行病学分析。因此利用基因组高通量测序技术补充淋球菌基因组学并结合其他实验室技术，以了解病原体的生物学和演化，改进临床诊断和治疗。同时各个国家应建立健全完整的淋球菌基因组数据共享，预测新的突变点及合理避免抗生素滥用的情况，能够有效控制淋病蔓延[19]。

参考文献：

[5]刘兰兰,田丽闪,袁军,等.淋球菌耐药现状及新药研究进展[J].中国艾滋病性病,2019,25(3):323-326.

薛方方,王义聪,杜美,李振红.高通量全基因组测序应用于淋球菌耐药的研究进展[J].中国艾滋病性病,2020,26(06):671-672+676.