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葛根素对大鼠脑缺血-再灌注损伤的影响

2021-02-25 2313 上传者：管理员

摘要：目的探讨葛根素对大鼠脑缺血-再灌注(I-R)损伤的影响及其机制。方法将72只SD大鼠随机均分为假手术组、I-R组和葛根素组。I-R组和葛根素组采用大脑中动脉梗阻法造模,缺血2h后予再灌注;葛根素组在造模前3d及造模后予肌肉注射葛根素注射液30mg/kg。再灌注3、6、12和24h时对各组大鼠行神经功能缺损评分、磁共振扩散峰度成像检查和神经元细胞HE染色,ELISA法检测脑组织炎症因子水平。再灌注24h时采用Westernblot检测脑组织蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路蛋白的表达。另取6只SD大鼠作为空白对照(空白组)。结果与假手术组比较,各时间点I-R组神经功能缺损评分、平均扩散峰度值(MK)、TNF-α、IL-6、IL-8水平和JAK1、JAK3、STAT1、STAT3蛋白表达水平升高,平均扩散系数(MD)降低(P<0.05)。与I-R组比较,各时间点葛根素组神经功能缺损评分、MD、MK、TNF-α、IL-6、IL-8水平和JAK1、JAK3、STAT1、STAT3蛋白表达水平均降低(P<0.05)。HE染色结果显示,空白组和假手术组神经元细胞形态正常,I-R组各时间点神经元细胞坏死和凋亡明显增多,葛根素组神经元细胞病理损伤较I-R组减轻。结论葛根素通过抑制JAK/STAT信号通路激活,减轻下游炎症因子释放,从而发挥脑保护作用。

关键词：
信号转导及转录激活因子
炎症因子
脑缺血-再灌注
葛根素
蛋白酪氨酸激酶
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缺血性脑血管病是由于脑部血管壁病变或血流受阻,导致供血区脑组织缺血、缺氧,造成脑组织坏死和神经功能缺损的疾病。随着我国人口老龄化的加快,脑血管疾病目前己经成为中国致死和致残的主要疾病之一,其中缺血性脑卒中最为突出,约占脑血管疾病的70%[1]。一项发表在《柳叶刀》杂志的最新研究亦证实,脑卒中已成为中国疾病负担重的主要原因[2]。脑缺血发生一定时间后,随着血流的再次恢复灌注,在多数情况下不仅没有使脑组织功能恢复,反而进一步加重缺血导致的结构破坏和功能障碍,是引起脑血管病恶化的重要机制之一,有效干预缺血-再灌注(I-R)损伤是预防脑损伤进一步加剧的重要环节[3]。

临床上葛根素多用于心脑血管疾病,具有降低脑内炎症因子和凋亡基因表达,减少巨噬细胞浸润、炎症反应和神经细胞凋亡等广泛多效性的药理作用[4]。动物实验证实葛根素可有效减轻大鼠心脏、肝脏I-R后损伤程度[5,6],但其中关于脑I-R损伤的相关机制鲜有报道。近年来研究发现,蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路参与脑I-R损伤的早期病理生理过程[7,8],在脑I-R损伤过程中扮演着重要角色,其相关蛋白基因在脑损伤后被激活并介导炎症反应,加重了神经元的损伤和凋亡。本研究以JAK/STAT信号通路上的相关蛋白基因为切入点,通过磁共振扩散峰度成像(DKI)所具有的对缺血病变组织微观结构异质性敏感的优势,探索葛根素对大鼠脑I-R损伤的影响及其作用机制,为临床应用提供依据。

材料与方法

一、材料

SPF级SD大鼠78只,体重(250±50)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,实验动物许可证号:SCXX(湘)2013-0004。适应性喂养1周后转入实验造模。葛根素注射液(成都天台山制药公司);总蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物科技公司);实验用一抗、二抗(武汉博士德生物公司);ELISA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

二、方法

1.动物造模与给药

采用随机数字表法将SD大鼠分为四组:空白组6只,假手术组、I-R组、葛根素组各24只。除空白组外,各组均按脑I-R后3、6、12和24h(即4个处死时间点)再分为4个亚组,每个亚组6只。采用线栓法对大鼠行大脑中动脉梗阻法造模[9],2h后拔出栓线约1cm,使血流恢复,建立大鼠脑I-R损伤模型。葛根素组在造模前3d及造模后肌肉注射葛根素注射液30mg/kg,大鼠给药剂量参照人与动物体表面积折算的等效剂量系数折算法[10],术后正常饲养,直至各处死时间点;I-R组用等体积生理盐水代替葛根素;假手术组在术中插入约0.8cm鱼线,不足以阻断大脑中动脉血流;空白组正常喂养。

2.神经功能评分标准

在脑I-R损伤后,观察记录再灌注后各时间点每组大鼠的神经缺损状况,参照Longa等[11]的5级神经功能缺损评分法对大鼠进行评分,观察各组大鼠神经功能缺损变化。

3.DKI操作方法

再灌注后各时间点腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后取仰卧位,用层笼固定扫描。采用GEDiscoveryMR750w3.0TMR扫描仪和32通道头线圈,扫描序列为DKI,将获得的DKI及弥散张量成像相关参数图像和数据传输至后台处理工作站,使用Functool-DKI工具包操作,通过标准后处理操作计算得到平均扩散峰度值(MK)图。

4.切片制作与染色

脑I-R损伤后在每个时间点随机取1只大鼠麻醉后处死,完整取脑后置入生理盐水中漂洗,剥离缺血侧脑组织后置于4%甲醛固定。漂洗,经不同浓度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,切片,HE染色,封片后在高倍视野下观察大鼠神经元细胞病理形态变化。

5.ELISA法检测脑组织炎症因子水平

再灌注后各时间点处死大鼠后取脑组织,将大鼠脑组织匀浆处理至完全裂解,试管分装保存。采用蛋白裂解液提取总蛋白后置入酶标板孔中,滴入生物素标记的抗体,加入ABC工作液,3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色,酶标仪在波长450nm处测定各孔的吸光度值,绘制标准曲线,计算结果。

6.Westernblot检测脑组织JAK/STAT信号通路相关蛋白

取再灌注24h后的脑组织匀浆样本,加入裂解液提取组织总蛋白,采用BCA法测定总蛋白浓度。配胶,电泳,转膜,封闭,加入一抗、二抗,孵育,用化学发光凝胶成像系统显影成像,采用Image-ProPlus6.0软件对结果进行灰度扫描分析,以β-actin为内参,计算各组灰度的比值。

三、统计学处理

采用SPSS24.0软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差(x¯±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析;计数资料用百分比表示,行χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、动物神经功能缺损评分

在脑I-R损伤后各时间节点处死前进行评分,空白组和假手术组大鼠的神经功能无缺损表现;I-R组和葛根素组大鼠在术后均出现不同程度的神经功能缺损症状;与I-R组相比,葛根素组大鼠在各个时间点的神经功能缺损评分降低(P<0.05)(表1)。

二、磁共振DKI

本研究所示各组梗死范围主要位于皮层下白质及侧脑室旁。假手术组平均扩散系数(MD)和MK在各时间点均无统计学差异(P>0.05);与假手术组比较,I-R组MD降低,MK升高(P<0.05);与I-R组比较,葛根素组MD及MK均降低(P<0.05)(表2)。

三、各组大鼠MK伪彩图

大鼠扫描完成后,分别取再灌注后每组各时间点的第3层扫描面计算的MK伪彩图进行观察,图中梗死区域呈暗红色(图1)。

表1脑I-R损伤后各组大鼠神经功能缺损评分的变化

表2脑I-R损伤后各组大鼠MD和MK的变化

图1I-R组(上)和葛根素组(下)的大鼠MK伪彩图

四、大鼠神经元细胞HE染色

空白组和假手术组:神经元细胞形态正常,结构清楚完整,细胞核大而规整、均匀。I-R组:细胞体早期出现肿胀,疏松淡染;随着灌注时间延长,神经元细胞坏死和凋亡明显增多,胞体缩小,并有中性粒细胞浸润;胞体缩小变形直至坏死,细胞核畸形,结构及核仁消失,细胞质内微空泡形成。葛根素组:神经元细胞早期水肿明显,随着灌注时间延长,细胞体出现固缩深染,见少量神经元细胞坏死,整体病理损伤改变较I-R组减轻。(封二图2)

五、大鼠脑组织TNF-α、IL-6和IL-8水平

与假手术组比较,各时间点I-R组TNF-α、IL-6和IL-8水平升高(P<0.01);与I-R组比较,葛根素组TNF-α、IL-6和IL-8水平降低(P<0.05)(表3)。

六、Westernblot检测大鼠脑组织蛋白的表达

空白组和假手术组再灌注24h后脑组织样本中JAK1、JAK3、STAT1、STAT3蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05);与空白组和假手术组比较,I-R组JAK1、JAK3、STAT1、STAT3蛋白表达水平升高(P<0.01);与I-R组比较,葛根素组JAK1、JAK3、STAT1、STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05)(图3,表4)。

表3脑I-R损伤后各组大鼠炎症因子水平的变化

图3各组相关蛋白的表达

表4再灌注24h后各组脑组织相关蛋白的表达

讨论

缺血性脑血管病发病机制复杂,JAK/STAT信号通路扮演了重要角色,目前已发现JAK存在4个家族成员(JAK1、JAK2、JAK3、TYK2),STAT存在7个成员(STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6),其中JAK1、JAK3、STAT1、STAT3是两者的主要成员,在中枢神经系统中广泛表达。JAK/STAT信号通路广泛参与多种促炎因子的转导,细胞增殖、分化、凋亡,血管形成及免疫调节等许多重要的生物学过程[12]。JAK/STAT信号通路的作用机制是细胞因子等配体与其相应的受体结合,形成二聚体或三聚体,并在细胞质内产生具有高亲和性的JAK结合位点,促使JAK与相应的结合位点结合,发生自身或者与受体交叉酪氨酸磷酸化而被激活,活化后的JAK与底物STAT蛋白相结合,使STAT被活化,活化的STAT离开受体转位至细胞核[13]。正常生理状态下,JAK/STAT以无活性的形式存在于细胞质中,当细胞外抗原刺激后,其被活化并转移至细胞核中,调控下游多种炎症相关因子表达,其过程是逐步递进的连锁级联效应。

炎症反应是脑I-R损伤病理过程中导致继发性脑损伤的关键因素,减轻炎症反应是治疗缺血性脑损伤的重要策略。早期脑缺血损伤机制之一启动了炎症级联程序,其过程涉及多种炎性细胞因子参与,以TNF-α、IL-8、IL-6等为代表的炎性介质失控释放而形成的“瀑布效应”是脑I-R损伤的免疫炎症反应的基础[14]。脑缺血后JAK/STAT信号通路的激活使组织中的炎症细胞大量活化,产生和分泌大量炎性细胞因子,这些炎性细胞因子密切关联机体的炎症反应,引发细胞因子反应逐级放大的瀑布效应,加重和诱发脑损伤。通过抑制JAK/STAT信号通路的激活,可减少脑组织的损伤[15]。本研究发现,JAK/STAT信号通路激活后,炎症因子表达升高呈一致性的趋势,提示JAK/STAT信号通路与炎性损伤有关,参与了早期脑I-R损伤的病理损伤过程。

葛根素是传统中药葛根中的有效化学成分异黄酮,具有扩张血管、保护心脏、抗炎和抗氧化等药理作用[16]。研究显示,葛根素能降低脑梗死模型半暗带区神经元自噬水平,减小脑梗死体积,减轻脑水肿和神经功能缺损[4]。于晓岚等[17]认为葛根素对脑梗死大鼠的神经功能和神经细胞凋亡具有改善作用,能抑制JAK2/STAT3信号传导途径所介导的炎症反应及氧化应激反应。研究显示,葛根素能有效减轻神经元细胞水肿、巨噬细胞浸润、炎症反应和视网膜神经节细胞凋亡[4]。

生理状态下,JAK和STAT的磷酸化在大鼠脑组织中正常表达,而发生脑损伤时其表达量则明显增加[18]。本研究结果显示,空白组和假手术组的JAK/STAT蛋白、炎症因子表达水平在各时间点均无统计学变化,I-R组JAK/STAT蛋白、炎症因子水平在各时间点升高,而葛根素组较I-R组降低,提示JAK/STAT信号通路参与了大鼠脑I-R损伤过程,介导炎症反应,葛根素可能是通过抑制JAK的磷酸化,从而抑制STAT的核易位,降低炎症因子水平而参与了神经保护,与相关报道一致[17]。同时,本课题组进一步应用DKI技术验证了上述实验结果,DKI对组织结构细微变化灵敏度高,可获得更有价值的组织微结构信息,在动物和临床实验中均证实了DKI对缺血病变更为敏感[19],通过DKI参数变化检测脑I-R损伤后的磁共振扩散信号改变,病理生理状态改变的微观监测变化与JAK/STAT信号通路蛋白、炎症因子表达水平呈相关性,以图像形式客观验证了葛根素对脑I-R损伤大鼠具有明显的神经保护作用。

综上所述,葛根素可能通过抑制JAK/STAT信号通路激活,减轻下游炎症因子的表达,从而发挥脑保护作用。

参考文献：

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