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Hb New York患者血红蛋白电泳与血常规指标研究

2020-10-28 1301 上传者：管理员

摘要：目的通过分析血红蛋白纽约（Hb New York）患者血红蛋白的电泳与血常规指标，为临床筛查相关血红蛋白病提供参考依据。方法回顾分析2014年3月至2018年12月广东地区送往广州金域医学检验中心筛查血红蛋白病的标本768 266例，采用红细胞参数、碱性（pH=8.6）琼脂糖凝胶血红蛋白电泳、红细胞渗透脆性试验（ROFT）及红细胞海恩氏小体孵育镜检，4种方法进行综合分析，对筛查出的Hb New York标本同时采用PRIMUS高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳进行验证，并随机抽取部分Hb New York标本以PCRDNA测序法进行基因突变测序鉴定。结果共筛查出966例Hb New York标本，广东地区Hb New York检出率为0.13%。其中，共检出9.1%(88/966)Hb New York杂合子复合珠蛋白生成障碍性贫血，其电泳浓度<40%,ROFT结果<60%，平均红细胞体积（MCV)<80fL;43.8%(423/966)Hb New York电泳浓度<40%,ROFT结果<60%,MCV<80fL。Hb New York杂合子复合α珠蛋白生成障碍性基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变的检出率为6.3%(61/966);47.1%(455/966)Hb New York电泳浓度>40%,ROFT结果>60%,MCV>80fL，珠蛋白生成障碍性贫血基因检测结果未检出α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变，为单纯Hb New York杂合子。Hb New York不同电泳浓度的患者部分血常规指标比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论不同电泳浓度的Hb New York血常规指标有所差异，广东地区人群Hb New York以单纯杂合子多见，其血常规指标多表现正常。复合珠蛋白生成障碍性贫血时，Hb New York患者可表现为缺铁性贫血。

关键词：
基因检测
异常血红蛋白病
电泳初筛
血液学表型
血红蛋白纽约
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血红蛋白病可分为两大类，一类是异常血红蛋白病，表现为血红蛋白珠蛋白肽链结构异常，如血红蛋白纽约（HbNewYork）、HbE、HbG、HbQ、HbS等，据世界卫生组织的报告，全世界大约有1.5亿人携带异常血红蛋白病的基因[1]，该病是最为常见的一种单基因遗传病[2]。HbNewYork是中国人群中一种常见的变异血红蛋白，属于β链变异，在第113位的β珠蛋白链上的氨基酸结构发生改变，谷氨酸取代缬氨酸。这种替换导致了α1和β1接触面除亚铁血红素组以外的区域面发生微妙变化，即致两者血红蛋白的电泳流动性和稳定性发生微小变化[3,4,5,6]。常见于复合珠蛋白生存障碍性贫血，严重者导致中度或重度贫血。另一类为珠蛋白生存障碍性贫血，是珠蛋白基因内部或其旁侧序列的突变，是珠蛋白肽链比例失衡所致的溶血性贫血[7]。相关分子生物学研究表明，无论是异常血红蛋白病，还是珠蛋白障碍性贫血，其分子基础相同，都是由于珠蛋白基因的突变所致[8]。近年来，血红蛋白病在我国发病率逐年升高，给社会与家庭带来了巨大的压力。目前，使用平均红细胞体积（MCV)[9]和红细胞渗透脆性试验（ROFT)[10,11]结果低于参考值进行血红蛋白病患者的初筛是较为常用的方法。因此，本文利用HbNewYork血液学表型数据分析和寻找筛查HbNewYork的快速方法，为疑似血红蛋白病患者诊断和治疗提供可靠的数据，同时也为预防珠蛋白生成障碍性贫血患儿的出生提供依据。现将结果报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选择2014年3月至2018年12月在广州金域医学检验中心筛查血红蛋白病的体检、婚检、孕检的768266例标本为病例组，其中男239630例，女528636例；年龄6～61岁，中位年龄28岁。选择100例在广州金域体检中心体检的健康者为对照组，男50例，女50例；中位年龄30岁；排除贫血或其他相关疾病。

1.2方法

1.2.1血常规分析

收集EDTA-K2抗凝血2.0mL，采用贝克曼COULTERLH750全自动血细胞分析仪作血常规分析[12]。ROFT采用广州米基公司生产的一管法，参考范围：ROFT结果<60%,MCV>80fL，红细胞（RBC）为（3.5～5.5）×1012/L，平均红细胞血红蛋白量（MCH）为27～34pg。血红蛋白A2(HbA2）参考范围为1.2%～3.5%。

1.2.2血红蛋白电泳分析

收集EDTA-K2抗凝血2.0mL，采用美国Helena公司全自动快速电泳系统（spife-3000），在碱性（pH=8.6）条件下电泳，由于各种血红蛋白具有不同的等电点，可分离出各种血红蛋白区带，进行定性或定量检测各种血红蛋白区带。同时用美国PRIMUS公司CLC385TMSystem-高效液相色谱（HPLC）或法国SebiaCapillarys毛细管电泳仪进行验证。

1.2.3Thal基因检测

GAP-PCR检测3种常见的缺失型α-Thal基因（--SEA、-a3.7与-a4.2），试剂由亚能公司提供，采用PCR结合反向点杂交法检测β-珠蛋白基因17个位点的18种突变，试剂由深圳益生堂生物公司提供。

1.2.4珠蛋白生成障碍性贫血判断标准

根据《血液病诊断及疗效标准》[13]电泳法结果诊断α珠蛋白生成障碍性贫血时HbA2临界值为≤2.6%，镜检Heinz小体阳性；诊断β珠蛋白生成障碍性贫血时HbA2临界值为≥3.8%，以基因检测为“金标准”。

1.2.5异常血红蛋白判断标准

当在电泳图谱中出现非“A”非“S”位置时，用毛细管电泳或HPLC法验证是快速或慢速带具体组别。HbNewYork以基因蛋白测序为“金标准”。

1.2.6β-珠蛋白基因序列扩增与测序

采用Primerpremier5.0软件设计扩增与测序，采用英俊公司的引物，基因扩增采用宝生物公司PrimeSTARHSDNAPolymerase酶反应体系，扩增产物使用加拿大Fermentas公司的试剂进行纯化，基因测序采用美国ABI公司的试剂与遗传分析仪进行分析。β-珠蛋白基因测序结果：杂合突变发生在β链上，基因突变型为1161C>T多态性，1371T>ATHbNewYork(HBB∶C.341T>C）突变杂合子，所使用的引物序列以beta-323Fa为正向（F）上游扩增引物，其引物序列（5′-3′）为ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA;beta+30Rb为反向（R）下游扩增引物，其引物序列（5′-3′）为TGGACTTAGGGAACAAAGGAAC-CTT；引物beta507F，序列（5′-3′）TGGCTCACCT-GGACAACC，与引物beta+30Rb，序列（5′-3′）TG-GACTTAGGGAACAAAGGAACCTT配对；引物beta1091F，序列（5′-3′）TGTATCATGCCTCTTT-GCA，与引物beta+30Rb，序列（5′-3′）TGGACT-TAGGGAACAAAGGAACCTT配对；引物beta-323Fa，序列（5′-3′）ATGCTTACCAAGCTGTGAT-TCCA，与引物beta540R，序列CATTCGTCT-GTTTCCCATT配对；引物beta-323Fa，序列（5′-3′）ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA，与引物beta1088R，序列GCAAAGAGGCATGATACATT配对（注：a同时为上游扩增引物，b同时为下游扩增引物）。

1.3统计学处理

采用SPSS18.0进行统计学分析。计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1HbNewYork检出情况

768266例标本共检出966例Hb New York,HbNewYork检出率为0.13%。HbNewYork杂合子复合珠蛋白生成障碍性贫血检出率为9.1%(88/966），其电泳浓度<40%,ROFT结果<60%,MCV<80fL。43.8%(423/966）的HbNewYork电泳浓度<40%,ROFT结果>60%,MCV>80fL。HbNewYork杂合子复合α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变的检出率为6.3%(61/966）。47.1%(455/966)HbNewYork电泳浓度>40%,ROFT结果>60%、MCV>80fL，基因检测结果显示，未检出α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变，为单纯HbNewYork杂合子。

2.2血红蛋白电泳结果

以MCV>80fL、HbNewYork电泳浓度>40%为A组，MCV<80fL、HbNewYork电泳浓度<40%为B组，MCV>80fL、HbNewYork电泳浓度<40%为C组。3组HbA2、HbNewYork电泳浓度差异无统计学意义（P>0.05），见表1。HbNewYork采用毛细管电泳法进行验证的结果显示，电泳结果未见异常。其碱性电泳结果见图1。

2.3ROFT结果

A组ROFT结果（92.85%±9.08%）与对照组（93.91%±11.35%）比较，差异无统计学意义（P>0.05);B组ROFT结果（45.0%±17.21%）与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05);C组ROFT结果（81.56%±13.86%）与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。A组与B组比较，两组ROFT结果差异有统计学意义（P<0.05);A组与C组比较，两组ROFT结果差异有统计学意义（P<0.05);B组与C组比较，两组ROFT结果差异有统计学意义（P<0.05）。

表1血红蛋白电泳结果下载原表

表1血红蛋白电泳结果

2.4A、B、C组与对照组RBC、血红蛋白、MCV、MCH的比较

4组间RBC、血红蛋白水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。B组MCV、MCH明显低于其他3组，差异有统计学意义（P<0.05);A、C组和对照组间MCV、MCH比较，差异无统计学意义（P>0.05）；见表2。

图1HbNewYork碱性电泳图

表2A、B、C组与对照组RBC、血红蛋白、MCV、MCH的比较下载原表

表3HbNewYork杂合子复合珠蛋白生成障碍性贫血基因检测结果[n(%)]下载原表

2.5HbNewYork不同浓度复合珠蛋白生成障碍性贫血基因类型的检出情况

结果显示，A组为单纯HbNewYork杂合子，未检出α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变；B组HbNewYork杂合子复合α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失12例，复合β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变76例；C组HbNewYork杂合子复合α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失22例，复合β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变39例。见表3。

3、讨论

本研究结果显示，广东地区HbNewYork检出率为0.13%，与温应方等[14]报道的结果差异较大，与李友琼等[15]结果相近，可能与标本来源不同有关。HbNewYork在电泳图谱上属于K组，突变发生于α1和β1接触面，属于轻度不稳定蛋白，大多数HbNewYork基因携带者无明显临床症状。关于HbNewYork的起源，较多研究者认为起源于客家人[16,17,18]。本研究是建立在血液学表型和基因型分析结果一致的情况下进行的，可以进一步地了解广东地区HbNewYork起源。结果显示，经碱性血红蛋白电泳筛查出的异常HbNewYork共966例，经测序证实与血红蛋白电泳完全符合，且均为HbNewYork(HBB∶C.314T>C）突变杂合子，其中817例为单纯HbNewYork突变杂合子，患者血液学检测指标基本无变化，只有在电泳时在HbA上方出现HbNewYork。本研究中的B组患者即HbNewYork杂合子复合珠蛋白生成障碍性贫血患者，均有不同程度的贫血症状表现，MCV、MCH、ROFT明显降低，同时还可见HbNewYork的浓度也降低，但RBC、血红蛋白及HbA2结果均在参考范围内，无明显血液学表现。

HbNewYork患者血常规指标（RBC、血红蛋白、MCV、MCH）正常或偏低，外周血涂片显示中度小红细胞症，临床易被诊断为缺铁性贫血。当琼脂糖碱性（pH=8.6）电泳图在紧邻HbA上方出现非“A”位置异常血红蛋白时，有必要用另外一种酸性电泳方法（pH=6.5）或HPLC、毛细管电泳去验证排除该变异为HbNewYork的可能性。若存在，则HbNewYork从HbA分离向阳极移动，而HPLC不能很好地将其分开，因为在HPLC中，HbNewYork和HbA的保留时间几乎一致。因此，筛查HbNewYork或排除HbNewYork复合珠蛋白生成障碍性贫血时，可通过HbNewYork在碱性和酸性琼脂凝胶电泳中的相对移动速度初步验证发现的异常HbNewYork，试验条件充足时可以用蛋白测序的方法确证。但杂合子的HbNewYork患者通常情况无临床症状，不会致病，因此，若排除珠蛋白生成障碍性贫血的夫妻双方，可以不用再做下一步的测序，减轻了患者经济负担。反之，需要排除HbNewYork复合珠蛋白生成障碍性贫血的可能性，避免夫妻同型生育重型珠蛋白生成障碍性贫血儿的风险，可为临床提供可靠的诊断依据。

而糖化血红蛋白（HbA1c）的测定会受到变异血红蛋白的干扰，使HbA水平下降，从而导致HbA1c的结果受到干扰，且变异血红蛋白也会被糖化，因此，如果患者检测出异常血红蛋白时，需把正常的HbA1c与变异血红蛋白糖化的部分相加才为HbA1c结果[19]。另有文献报道，血小板计数也会因为异常血红蛋白受到干扰[20]。因此，在血红蛋白病高发的地区，建议采用ROFT、红细胞参数检测、碱性血红蛋白电泳进行联合初筛，同时对筛查出的异常血红蛋白进行验证以示区别。本文对部分HbNewYork基因测序进行确诊HbNewYork基因突变杂合子，符合率达100%。可见，血红蛋白电泳联合ROFT及血常规检测可作为筛查HbNewYork的一种较好且快速、简便的方法。

4、结论

不同电泳浓度的HbNewYork血常规指标有所差异，广东地区人群HbNewYork以单纯杂合子多见，其血常规指标多表现正常。复合珠蛋白生成障碍性贫血时，HbNewYork患者可表现为缺铁性贫血。

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