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观察分析PNPLA2基因多态性与中国汉族2型糖尿病患者缺血性脑卒中关系

2020-07-08 473 上传者：管理员

摘要：目的:探讨脂肪甘油三酯脂酶基因PNPLA2 rs1138693 (T> C,L481P)多态性与中国汉族人群2型糖尿病患者缺血性脑卒中发生风险的相关性。方法:病例对照研究共纳入368例中国2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者(139例T2DM缺血性脑卒中患者和229例T2DM非缺血性脑卒中患者作为对照组)，利用Taqman探针实时聚合酶链式反应TaqMan MGB Real-time PCR对PNPLA2 rs1138693(T> C)进行基因分型，并采用SPSS 20.0进行统计分析。结果:对照组和缺血性脑卒中组患者临床资料中的年龄、性别、血压和同型半胱氨酸水平存在统计学差异(P <0.05)。缺血性脑卒中组患者PNPLA2 rs1138693位点的CC基因型频率和C等位基因频率显著低于对照组(基因型频率:P=0.033;等位基因频率:P=0.011)。Logistic回归分析发现，在加性、显性和隐性遗传模型下，PNPLA2 rs1138693等位基因C是T2DM患者进展为缺血性脑卒中的保护因素(P <0.05)。结论:PNPLA2 rs1138693基因多态性与中国T2DM患者发生缺血性脑卒中的易感性有关，携带rs1138693 C等位基因的T2DM患者更不容易进展为缺血性脑卒中。

关键词：
2型糖尿病缺血性脑卒中
PNPLA2基因
基因多态性
并发症
糖尿病
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2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)在全球发生率越来越高。2015年全球糖尿病病例估计为4.15亿例，预计到2040年将增加到6.42亿[1]。中国最新糖尿病流行病学调查显示，根据美国糖尿病协会诊断标准，中国成年人总糖尿病患病率为12.8%，估计糖尿病患者总数为1.298亿;糖尿病前期患病率为35.2%[2]。血糖控制可有效改善糖尿病微血管病变，但对大血管病变的改善作用甚微[3]。糖尿病大血管病变是T2DM患者致残、致死的主要影响因素[4]。据报道，T2DM患者发生缺血性脑卒中风险是一般人群的2～4倍[5],T2DM缺血性脑卒中是一种多基因遗传性疾病，是环境与遗传因素共同作用的结果[6,7]。因此，开展T2DM缺血性脑卒中的基因多态性研究有助于揭示其遗传学基础，发现潜在治疗靶点。

新近研究表明，脂质代谢异常与2型糖尿病患者脑卒中的发生风险有关[8]。脂肪甘油三酯脂肪酶(triglyceride lipase,ATGL)由PNPLA2基因编码，是脂解过程的重要组成部分，是启动甘油三酯分解代谢的限速酶[9,10]。PNPLA2在脂肪和非脂肪组织脂代谢过程中都发挥着重要作用。2006年Schoenborn等招募了2 434名欧洲裔受试者，包括严重肥胖患者、冠状动脉疾病患者和对照人群，分析了PNPLA2基因12个位点的遗传多态性，结果发现PNPLA2基因多态性与血糖水平和2型糖尿病具有显著的相关性[11]。PNPLA2基因敲除小鼠包括心肌、肝脏和肾脏等内脏器官中发现存在大量甘油三酯聚集，且该基因与糖尿病肾脏疾病等糖尿病微血管并发症密切相关[12,13]。但是PNPLA2基因与糖尿病缺血性脑卒中的研究较少。本文旨在研究PNPLA2基因rs1138693(T>C,L481P)多态位点与中国T2DM患者发生缺血性脑卒中的关系。

1、资料与方法

1.1研究对象

本研究为临床病例-对照研究，共纳入368例确诊为2型糖尿病的患者，他们均为2015年2月至2016年6月在中日友好医院住院的患者。其中病例组共139人，均有缺血性脑卒中病史;对照组229人，被诊断为2型糖尿病至少10年且无缺血性脑卒中病史。2型糖尿病诊断标准参照1999年世界卫生组织WHO修订的糖尿病诊断及分型标准。符合以下条件的可诊断为缺血性脑卒中:急性局灶性或全身性神经功能缺损持续时间超过24 h，除血管起源外无明显原因，并在发病后72 h内连续经脑计算机断层扫描或磁共振成像扫描确认。同时排除脑出血、脑静脉血栓形成和脑肿瘤患者。

1.2临床资料收集

收集368例2型糖尿病患者的临床信息，包括:是否吸烟、高血压病史、BMI、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)等。其中，BMI计算方法是体质量(kg)/身高平方(m2)。静息血压按标准方案测量两次，取平均值。空腹TG、TC、LDL-C、HDL-C、Hcy浓度等生化指标则采用全自动生化分析仪(AU5800临床化学系统，Beckman Coulter,Brea，美国)测定;采用D-10血红蛋白检测系统(BioRad,Hercules,CA，美国)测定HbA1C浓度。

1.3外周血DNA提取

采集2型糖尿病患者外周血1 m L，利用QIAamp DNA blood Mini试剂盒(Qiagen,Hilden，德国)从外周血中提取DNA，经NanoDrop 1000分光光度计测定DNA浓度后，保存于-20℃或立即扩增。

1.4 PNPLA2 rs1138693(T>C,L481P)多态性分析

采用Taq Man SNP探针基因分型方法(Applied Biosystems，美国)对PNPLA2 rs1138693进行基因分型。冰上配制总体积为25μL的PCR反应液体系，包括:50 ng DNA,PCR扩增试剂2×Premix Ex Taq(Takara，日本)12.5μL,10μmol/L上、下游扩增引物各0.5μL,3 pmol SNP rs1138693基因分型探针。PNPLA2 rs1138693引物序列如下:上游引物，5'-AGAGGGGTCTTTGCCGTGG-3';下游引物，5'-GCAAG-TAAGCAG GCGGTCAC-3'。在ABI7500实时荧光定量PCR仪设置如下扩增程序，第一步:95℃预变形10 min;第二步:95℃变性5 s,60℃退火和延伸30 s，持续40个循环。根据基因分型结果，随机选取多个不同基因型样本进行DNA测序，以确认基因分型结果。

1.5统计学处理

所有数据均采用SPSS 20.0软件进行分析。对照组和缺血性卒中组临床资料，包括年龄、BMI、血压、糖尿病病程、HbA1C、TC、HDL-C、LDL-C、TG、Hcy均为非高斯分布，以中位数(四分位范围)表示，并采用Wilcoxon符号秩和检验比较两组临床资料差异的显著性。卡方检验分析基因型分布、等位基因频率以及哈迪-温伯格平衡检验。最后，根据年龄、性别、BMI、高血压病史、TC、TG和HDL-C在加性、隐性或显性模型中的调整，对rs1138693多态性与缺血性卒中风险之间的关系进行logistic回归分析。为了定义这些模型，对于SNP rs1138693位点来说，C是次要等位基因。显性模型中TT和TC编码为1,CC编码为0。对于隐性模型，CC编码为1,TC和TT编码为0。对于加性模型，CC、TC、TT分别编码为2、1、0。

2、结果

2.1临床资料比较

临床样本分析共纳入368例T2DM患者，其中139例患有缺血性脑卒中，229例无缺血性脑卒中病史(Tab.1)。两组患者在BMI、糖尿病病程、吸烟、HbA1C、TC、HDL-C和LDL-C等临床资料无统计学差异;而在年龄、性别、血压、Hcy等存在统计学差异(P<0.05)。

2.2两组患者PNPLA2 rs1138693(T>C)基因型和等位基因频率分布

T2DM患者对照组和缺血性脑卒中组PNPLA2 rs1138693(T>C)基因型和等位基因频率分布如Tab.2所示。经卡方检验，两组患者rs1138693等位基因频率分布符合哈迪-温伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)(P>0.05)，且在中国汉族人群中存在高度的遗传多态性(次要等位基因C频率>5%)，表明该人群适合进行遗传分析。两组患者PNPLA2rs1138693(T>C)的基因型和等位基因频率存在统计学差异(基因型，P=0.033;等位基因，P=0.011)。

2.3 PNPLA2 rs1138693多态性与T2DM缺血性脑卒中的相关性

为了明确PNPLA2 rs1138693多态性对T2DM缺血性脑卒中发生风险的贡献，我们采用Logistic回归分析方法，分别在加性、显性和隐性遗传模型下分析PNPLA2 rs1138693多态性与糖尿病缺血性脑卒中发生风险的相关性(Tab.3)。结果表明，在加性和隐性遗传模型中，PNPLA2 rs1138693 CC基因型是T2DM缺血性脑卒中的保护因素(加性模型:校正OR=0.379,95%CI 0.175-0.820,P=0.014;隐性模型:校正OR=0.450,95%CI 0.215-0.939,P=0.033);而在显性遗传模型中，PNPLA2 rs1138693 TC+CC基因型与T2DM缺血性脑卒中的低风险有关(校正OR=0.618,95%CI 0.392-0.972,P=0.037)。

3、讨论

脂质代谢异常是2型糖尿病患者发生缺血性脑卒中的风险因素。脂肪甘油三酯脂酶AT-GL由PNPLA2基因编码，是启动TG分解代谢的限速酶，对维持脂质平衡至关重要。在本研究中共纳入368名2型糖尿病患者(229名T2DM患者无缺血性脑卒中患者和139名T2DM缺血性脑卒中患者)，分析PNPLA2多态性对中国汉族人群2型糖尿病患者发生缺血性脑卒中风险的易感性。我们发现在两组患者中，PNPLA2rs1138693(T>C)的基因型频率有统计学差异。T2DM缺血性脑卒中患者rs1138693位点C等位基因频率明显低于对照组。结果提示，PNPLA2rs1138693可能在中国汉族T2DM人群中发生缺血性脑卒中的风险中起重要作用。

2型糖尿病主要特征是高血糖，在糖代谢紊乱情况下常伴随脂质代谢的紊乱，过多的血脂沉积于血管壁，进一步加重血管硬化，加速动脉粥样硬化斑块的形成。低水平HDL-C是导致脂蛋白异常的主要因素之一，已被发现与2型糖尿病患者患心血管疾病风险的增加有关[14]。最新的一项大型队列研究发现，2型糖尿病患者中血清HDL-C水平与总的脑卒中发生风险以及出血性和缺血性卒中风险都呈负相关[8]。研究者对两组患者的血脂水平进行对比发现，2型糖尿病合并缺血性脑卒中患者的TC、TG、LDL-C、Apob、尿蛋白/肌酐水平明显高于单纯2型糖尿病患者，而HDL-C、Apoa水平明显低于单纯2型糖尿病患者[15]。提示了2型糖尿病合并缺血性脑卒中患者机体脂质代谢紊乱状态更加严重，而脂质代谢紊乱可引起或加重动脉粥样硬化进程，增加缺血性脑卒中的发生风险。

2004年三个独立的实验室首次发现了位于11p15.5染色体上的PNPLA2基因[16,17,18]。PNPLA2基因包含10个外显子，编码了一个含有504氨基酸的脂肪甘油三酯脂酶ATGL蛋白[19]。ATGL普遍表达于各类组织中，但主要在脂肪组织中。作为TG水解的初始限速酶，ATGL在维持脂质代谢的动态平衡中起着关键作用。正常情况下，机体吸收自由脂肪酸形成TG，并储存在脂滴中。当机体能量需求增加时，ATGL可催化TG水解为二酰甘油(DG)和游离脂肪酸(FA)。随后，DG被激素敏感脂肪酶水解成单甘油酯(MG)和FA，而单甘油酯脂肪酶将MG裂解成甘油和FA。最后，释放的FA将作为能源生产的基质。脂肪异常分解导致循环FA水平升高，从而导致脂肪毒性，包括胰岛素抵抗、2型糖尿病、脂肪肝和炎症[20,21]。有研究表明，与单纯的2型糖尿病组相比，2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝组的ATGL表达明显下降，ATGL水平可预测2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝的发生发展及严重性[22]。另外，ATGL表达水平及活性与糖尿病肾病等糖尿病微血管并发症密切相关[23]。但是ATGL与糖尿病大血管并发症的关系尚不明确。本研究从基因遗传多态性入手，首次发现了PNPLA2基因SNP位点rs1138693(T>C)是T2DM患者进展为缺血性脑卒中的易感位点，其等位基因G与脑卒中发生的高风险有关。

本研究仍然存在一些潜在的局限性。首先，本研究样本量相对有限，如果能够招募更多2型糖尿病患者组成更大的研究队列，将进一步提高研究结论的可靠性。其次，本研究选择了位于PNPLA2基因编码区错义SNP位点rs1138693(T>C,L481P)作为研究对象，发现了其与中国汉族人群T2DM患者缺血性脑卒中的显著相关;在未来的研究中可以寻找更多的T2DM发生缺血性脑卒中的易感SNP位点，开展易感SNP的功能研究以寻找功能变异位点，建立基因型-表型相关性。

综上所述，我们的研究表明，在中国汉族人群中rs1138693 CC基因型和C等位基因与T2DM缺血性脑卒中的低风险显著相关。据我们所知，这是首次确定PNPLA2基因和T2DM缺血性脑卒中之间的相关性研究，因此，本结果还有待于在更大规模、不同种族的人群中开展前瞻性研究进行验证。

参考文献：

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赵海玲,张浩军,赵婷婷,严美花,董晞,马亮,李平.PNPLA2基因多态性与中国汉族2型糖尿病患者缺血性脑卒中的相关性研究[J].中国临床药理学与治疗学,2020,25(06):664-669.

基金:北京市自然科学基金项目(7192191);国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目(81620108031).