圆锥角膜(keratoconus, KC)是一种双侧不对称的退行性疾病，是最常见的角膜原发性扩张，角膜的逐渐变薄和变性，会导致不规则散光和视力下降。通常发生在青春期前后，影响所有性别和种族，根据国家和地区的不同，已确定圆锥角膜的患病率为1∶375至1∶2 000,由于特定的遗传条件和可能的环境条件，一些国家的患病率甚至更高。然而眼部症状和体征因疾病严重程度而异，因此早期圆锥角膜通常不会被注意到[1-3],在疾病晚期，角膜轴向瘢痕还会进一步影响视力，降低患者的生活质量。关于圆锥角膜管理方法，包括早期配戴框架眼镜、隐形眼镜和交联治疗，晚期进行角膜移植等，均可以改善患者生活质量，但其生活质量评分与临床指标相关，包括视力、角膜地形图、厚度测定和圆锥角膜严重程度等[4]。因此，明确圆锥角膜发病机制，采取针对性的治疗措施，对防止疾病进展、改善患者生活质量至关重要。但目前，确切的发病机制尚不清楚，可能与环境因素、种族差异、力学刺激(揉眼)、激素水平、营养代谢等相关[5-9]。不少研究已经通过全基因组关联研究、家族的连锁分析和连锁区域精细定位、双胞胎研究等明确了在某些遗传位点上基因的改变会导致圆锥角膜的发生风险增加，即使在没有该疾病家族史的人群中也是如此[10-11]。许多基因，包括视觉系统同源盒1(visual system homeobox 1,VSX1)基因、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)基因和赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)以及基因突变都与圆锥角膜相关[12]。这为理解圆锥角膜复杂遗传学及其临床意义，提出了未来遗传研究的方向，随着圆锥角膜新功能候选基因的快速发现，圆锥角膜发病机制的分子遗传机制研究将帮助我们更好的认识及理解圆锥角膜，并促进新疗法的发展[13]。本综述旨在阐述不同基因对圆锥角膜发病机制的影响，在遗传领域，为寻找圆锥角膜预防和干预治疗的新方法开辟更多可能性。

1、角膜重塑相关基因

1.1 LOX基因

位于5q23.1的LOX基因编码一种依赖铜的氧化脱氨酶(赖氨酸氧化酶),它通过氧化赖氨酸残基和促进胶原和弹性蛋白形成共价交联来维持细胞外基质(ECM),ECM是一种动态结构和调节框架，对于发育、维持和修复过程中的细胞分化和信息传递至关重要。LOX使ECM在细胞外环境中不易溶解，在圆锥角膜患者的角膜中检测到LOX活性降低(约38%)、分布降低(约63%)或异常低表达，表明其降低幅度与疾病严重程度相关，提示该基因在疾病发病机制中起重要作用[14-18]。Gadelha等[19]在一个杂合患者的LOX外显子6中发现了一个未报道的错义变异，导致LOX蛋白序列残基392处脯氨酸被苏氨酸取代(p.Thr392Pro),预计会调节或在LOX转录本中产生供体或受体剪接位点，这种突变对LOX蛋白有潜在的破坏作用，而位于LOX蛋白序列残基392处的苏氨酸在原始人中非常保守，但在系统发育较远的物种中则相反。Bykhovskaya等[20]在全基因组关联研究(GWAS)中发现了病例组中LOX内含子4的SNPs rs10519694和rs2956540处的关联证据，该发现被Niazi等[21]验证，rs2956540C等位基因携带者在圆锥角膜病例中的发生率明显高于对照组。通过基于家族的关联测试发现相同的2个单核苷酸多态性(SNP)与圆锥角膜相关，同时通过分析病例和家庭样本，对圆锥角膜患者亚群中LOX外显子的测序鉴定出两个多态性，即rs1800449和rs2288393,分别位于LOX转录本I和II中，而位于LOX基因外显子I的第一个变体上的G-to-A转换，导致LOX转录本I蛋白中的精氨酸(Arg)被替换为谷氨酰胺(Gln),这种改变表明LOX变异导致圆锥角膜的易感性增加[20-21]。通过使用等位基因特异性PCR对LOX变异进行基因分型发现，+473A/rs2288393C和+473G/rs2288393单倍型被确定为圆锥角膜的危险因素，LOXrs1800449基因型(AA和GA+AA)和等位基因(A)增加了圆锥角膜易感风险[22]。以上基因序列改变均可以用于圆锥角膜风险预测。

1.2肝细胞生长因子基因

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)由基质细胞和间充质细胞分泌，其受体c-Met在平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞等多种细胞上表达，HGF以旁分泌和自分泌方式刺激上皮和内皮细胞增殖、运动，保护细胞免受细胞凋亡。HGF被认为是一种有效的抗炎和抗纤维化生长因子，相对于其他血管生长因子，HGF对缺血组织具有多种作用[23-24]。多种组织特异性MET敲除小鼠的研究表明，HGF-MET通路促进组织再生，防止细胞死亡，并抑制不同组织和细胞类型的慢性炎症和纤维化的进展[25]。Cheung等[26]分别从圆锥和非圆锥角膜中央角膜的基质细胞中提取总蛋白，采用基于化学发光的免疫阵列定量检测HGF水平，发现在诱导继发性损伤(SI)的圆锥角膜基质细胞中(与-SI正常角膜相比),HGF和β-NGF水平降低。You等[27]通过对比晚期圆锥角膜和对照组角膜中HGF及其受体间充质-上皮转化因子(c-Met/Met)的研究表明，HGF的基因变异与发生圆锥角膜的易感性增加有关，是参与圆锥角膜发生的潜在关键基因[28]。Dudakova等[29]使用竞争性等位基因特异性PCR测定，应用fisher精确检验评估关联的强度，在两个测试基因座上都发现了关联的证据，即在HGF附近rs3735520:G>A最强，A等位基因为危险因素；rs2956540:G>C,在LOX中，C等位基因具有保护作用；rs2956540:G>C和rs3735520:G>A的首次独立关联验证表明，HGF位点的遗传变异与圆锥角膜易感性增加有关[30],这些SNP可作为欧洲血统个体中圆锥角膜的遗传风险标志物。而Lucas等[31]的研究则认为HGF基因中罕见的潜在致病变异在圆锥角膜易感性和发病机制中不起主要作用，但因病例数较少而有待进一步确定。Sahebjada等[32]对澳大利亚人群HGF基因与圆锥角膜关联的研究为HGF基因与圆锥角膜的显著关联提供了额外的证据。而对汉族人群圆锥角膜遗传位点的评估研究则发现rs3735520 [HGF附近(5')]基因型与圆锥角膜的关联同对照组未见明显差异[33]。可见HGF基因与圆锥角膜之间的关联强度具有显著种族差异性。

1.3 SOD1基因

SOD1基因位于21q22.11,其以活性氧(ROS)清除活性而闻名，SOD1编码一种铜和锌依赖的细胞质酶，该酶通过氧化还原反应将自由基超氧化物转化为分子氧和过氧化氢，以维持氧化还原平衡，此外，SOD1被证明是酵母的代谢焦点，用于整合营养有效性，调节呼吸和发酵之间的转换，介导代谢机制，近几年的研究还揭示了翻译后修饰(PTMs)调控SOD1的新机制，其激活核基因转录或作为RNA结合蛋白等多种功能也逐渐被发现，可以直接参与圆锥角膜患者角膜细胞中ROS消除和氧化应激减少相关的抗氧化过程，在SOD1上发现了磷酸化位点，以及氧化还原、棕榈酰化、硝酸化位点，其中一些位点与调节SOD1在清除ROS、维持细胞骨架和转录中的作用有关[14,34-35]。不少研究认为SOD1参与圆锥角膜发病的某一步骤，将其作为候选基因[36-38],Udar、Moschos等[39-40]的研究更是有力地支持了SOD1基因内含子2中7碱基缺失(c.169+50delTAAACAG)对圆锥角膜发病的独特性，表明SOD1可能在圆锥角膜的发病机制中起致病作用。在巴西晚期圆锥角膜患者的SOD1基因变异是否存在的研究中，检测到1例严重圆锥角膜的患者SOD1缺失，但由于数据限制，这种变异在调节受影响个体角膜转录水平方面的作用需要进一步研究[19]。然而不少研究持相反意见[31,41-43],因为在对不同地区、种族的圆锥角膜患者进行DNA测序时，并未发现与圆锥角膜相关的SOD1致病性基因突变。因此，到目前为止，关于SOD1对圆锥角膜发病的贡献仍众说纷纭，其机制需进一步研究探索。

1.4 VSX1基因

VSX1基因是一个编码配对型同源结构域和CVC结构域的同源框基因，最初从成年金鱼视网膜文库中克隆而来，在人体颅面和眼部组织的早期发育中起着重要作用[44]。在许多验证VSX1是否为圆锥角膜发病候选基因的研究中，通过直接测序分析VSX1基因的整个编码区和外显子-内含子连接，未能找到支持证据[42,45]。在VSX1的基因测序中发现2个SNP: g.8326G>A(c.627+23G>A, rs58752432)和g.7898g>A(c.503+202G>A,rs59089167),以及VSX1中的一些遗传变异(p.L17P、p.D144E、p.R166W等)已被确定对圆锥角膜患者有害，此外，VSX1与其预测的伴侣蛋白之间的相互作用被破坏可能导致VSX1致病性突变，但其突变在疾病中的表现需进一步研究[41]。Zhang等[46]对中国西北地区圆锥角膜家族的研究鉴定出VSX1基因编码蛋白质中的3种错义变异(p.G342E、p.G160V和p.L17V),通过结构建模表明，这3种错义突变位于VSX1基因的功能域，成为圆锥角膜患者的潜在致病变异，其中p.G342E中的同义变异(p.R27R)和内含子(c.425-73C>T)发生了杂合变化，表明VSX1的p.G342E变异与圆锥角膜的发病机制有关，这扩大了VSX1突变谱的范围。Guan等[47]在中国散发性圆锥角膜病例中，观察到VSX1基因有4个核苷酸序列变异，包括2个错义序列变异和1个SNP改变(杂合子和纯合子),其中VSX1基因的第1个外显子中c.5427G>C错义序列变异(CGC→CCC),导致密码子131处精氨酸被替换为脯氨酸(p.Arg131Pro);VSX1基因的第2个外显子中c.7672G>T错义序列变异(GGC→GTC),导致密码子160处甘氨酸取代缬氨酸(p.Gly160Val)。Deva等[48]在对马来西亚圆锥角膜患者的基因测序中发现3个基因变异(p.A182A、p.P237P和p.R217H),其中前两者有助于圆锥角膜发展，而p.R217H似乎对圆锥角膜的发展提供了一些保护，然而由于研究样本量小，且没有对种族和性别进行单独的分析，该研究结果有待进一步研究验证。在对巴西圆锥角膜患者VSX1变异分析中发现VSX1外显子1中3个非同义替换(L68H、R131S和D105E),其中L68H突变是该基因的新变异，当L68H与其他多态性基因位点结合时可能会增加疾病的严重程度[49],此外，在对波兰、伊朗、中国汉族圆锥角膜患者的研究中均发现VSX1基因变异与圆锥角膜的风险相关[50-52],Saee-Rad等[38]发现VSX1基因p.R166W和p.H244R的改变与不同种族圆锥角膜患者之间存在显著关联，而有研究证明了与圆锥角膜相关的VSX1突变会改变高度保守的氨基酸残基，从而在体外改变VSX1的转录活性[53]。以上均可支持VSX1是负责圆锥角膜的合理候选基因，表明VSX1序列变异可能与散发性圆锥角膜的发病机制有关，基因筛查联合临床表型分析有助于圆锥角膜患者的遗传咨询和亚临床圆锥角膜个体的识别。

2、与转录翻译相关的基因

2.1锌指蛋白469基因

锌指蛋白469(zinc finger protein 469,ZNF469)基因作为一种转录因子，与中央角膜厚度(CCT)相关，是参与调节ECM成分合成和降解的关键基因，其罕见的错义突变(预测为致病性)以杂合子方式发生，是胶原相关蛋白中最常见的基因变异，会导致患者的圆锥角膜和整体角膜变薄，总之，ZNF469是确定CCT与导致脆性角膜综合征(BCS)隐性功能丧失突变的强相关因素[54-56]。Stanton等[57]的研究表明ZNF469中的致病突变分布在整个蛋白质中，并导致C2H2锌指结构域中保守残基过早终止密码子或破坏，而角膜中I型和V型胶原蛋白的相对丰度是维持ECM成分的关键，纯合ZNF469突变是由于角质细胞编码I型胶原蛋白α1和α2链的Col1a1和Col1a2基因表达降低约50%,导致的基质厚度减少，从而引起中央和外周角膜变薄。在约12.5%的圆锥角膜患者中，预测出ZNF469中罕见的潜在致病性等位基因的富集使得该基因的突变率增加，并强调ZNF469可能是迄今为止发现的导致圆锥角膜最重要的遗传因素[58],不少研究也表明了ZNF469基因变异与圆锥角膜的发病机制有关[59-60],并利用PCR技术揭示了ZNF469是单个外显子而非双外显子基因[61]。在中国圆锥角膜患者中，ZNF469编码区共鉴定出16个序列变异，其中c.2059G>A、c.2137C>A、c.3466G>A、c.3749C>T、c.4300G>A、c.4684G>A和c.7262G>A被确定为具有潜在破坏性；而c.3466G>A突变也被证明参与胞质分裂9(DOCK9)的突变(c.1940C>T)[62]。对新西兰、比利时、法国和意大利的圆锥角膜患者进行基因测序检测到ZNF469基因遗传变异的富集[63-64]。在捷克队列中复制SNP与圆锥角膜的关联，发现rs1324183的相关性最强，rs2721051和rs4954218也获得了统计学意义值，支持这些位点与疾病发展风险的关联[65]。然而在波兰和欧洲血统的澳大利亚圆锥角膜患者中，研究者们没有发现ZNF469序列变异的显著富集[66-67]。因此，尽管在特定人群中ZNF469基因变异与圆锥角膜发病相关性显著，仍有必要进行复制研究从而了解该基因在圆锥角膜中的作用。

2.2 TGFBI基因

编码角膜上皮素(KE)的转化生长因子-β(TGF-β)诱导基因(transforming growth factor-beta-induced, TGFBI)的点突变已在患有角膜疾病的群体中得到证实[68],TGF-β是包括眼前节在内的多种组织中调节ECM分泌和产生的关键调节因子，在胚胎发育、器官发生、免疫监督、组织修复和细胞稳态等方面也发挥着重要作用，在病理条件下，许多不同的细胞类型(包括巨噬细胞、上皮细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞等),可以产生和分泌更多的TGF-β,过表达的TGF-β会通过SMAD(由TGF-β所存在的细胞内激酶结构域的TβRII募集和磷酸化TβRI,形成TβR II和TβR I异聚体复合物，被激活后与Co-SMAD/SMAD4结合，形成三聚体复合物，共同聚集在细胞核中，以调节从胚胎发育到成年生物体的靶基因表达)途径和非SMAD(TGF-β通过磷酸化、乙酰化、泛素化和蛋白-蛋白相互作用激活的所有通路和下游级联反应)途径介导，导致上皮-间充质转化(EMT)、ECM沉积以及癌症相关成纤维细胞(CAF)形成等，从而导致纤维化疾病[69]。区别于不能准确反映体内角膜细胞特性的角膜细胞系或泪液样本，研究者利用现代生物信息学分析增强的RNA-Seq方法测试了圆锥角膜与非圆锥角膜个体角膜的RNA样本，对圆锥角膜的角膜进行全面的转录组分析，发现胶原蛋白合成和成熟途径的广泛破坏，以及影响角膜组织的TGF-β信号通路核心元件的下调在圆锥角膜发生发展中起着重要作用[70]。Guan等[71]对圆锥角膜患者血液样本进行聚合酶链反应-单链构象多态性及DNA直接测序，检测到TGFBI基因编码区的外显子12中发现了两种类型的碱基突变，分别是位点535显示GGA→TGA取代，即从甘氨酸到终止密码子(G535X)的变化；位点540显示TTT→TTC取代，而苯丙氨酸(F540F)的编码没有改变，提示多态性，表明该基因可能在中国人群圆锥角膜的发生发展中发挥作用，然而环境与遗传易感性的相互作用如何促进疾病进展仍有待研究。此外，有研究者在1例同时患有圆锥角膜和颗粒性角膜营养不良(GCD)的23岁男性患者中发现了TGFBI基因中的错义突变(c.370G>A)[72],在中国汉族人群中发现TGFBI基因突变(c.624+7->A)[73]。在对科尼亚地区I型GCD家族中TGFBI基因突变的研究中，通过对TGFBI基因外显子12区的序列分析，发现所有诊断为GCD1的患者均为Arg555Trp(c.1663C>T)突变[74]。Karolak等[75]使用RT-qPCR测定基因表达水平发现圆锥角膜患者角膜中TGFBI上调最多，这与前人RNA测序(RNA-Seq)结果具有很强的相关性，表明其变异与圆锥角膜发生有关。

2.3锌指E盒结合同源框1基因

锌指E盒结合同源框1(zinc-finger E homeobox-binding1,ZEB1)基因是EMT、细胞分化和转化调控的重要转录因子，在角膜上皮基底细胞、血管内皮细胞和浸润免疫细胞中高度表达，通过SP1和SP3在间充质转化诱导的角膜内皮纤维化中起核心作用，参与维持内皮细胞密度，从而保持角膜透明度，ZEB1功能障碍可能会影响角膜干细胞稳态，并引起角膜细胞凋亡、基质纤维化、血管生成、鳞状化生等，表明ZEB1可以靶向抑制眼前节纤维化[76-77]。Lechner等[78]在一个患有圆锥角膜和Fuchs内皮角膜营养不良的家族中发现了ZEB1外显子7(c.1920G>T;p.Gln640His)的新型杂合致病突变，核苷酸变化导致保守的极性氨基酸谷氨酰胺被带正电荷的碱性氨基酸组氨酸取代，尤其是在PPCD3的患者中常见其突变，而对患有圆锥角膜、上皮基底膜角膜营养不良(EBMCD)和Fuchs内皮角膜营养不良(FECD)的三重角膜营养不良关联患者的ZEB1突变进行基因检测发现其外显子7(c.1920G>T;p.Gln640His)的杂合突变呈阳性[79],这也进一步支持ZEB1突变在角膜病变中的作用。在最近的基因测序中发现ZEB1基因(TCF8)发生了杂合c.1A>C(p.Met1Leu)突变，该基因介导细胞系之间的过渡，并为角膜内皮的上皮化提供了致病性解释[80]。关于ZEB1在圆锥角膜及角膜疾病中的作用机制随着更多突变位点的发现将会有助于后续研究。

3、其他相关基因

除上述详细介绍的基因以外，还有不少基因已被证明为圆锥角膜候选基因。线粒体DNA(MTDNA)中m.16180_16181delAA的异质水平被揭示与圆锥角膜相关[81];Bortoletto等[82]的研究表明，与对照组相比，圆锥角膜的RNA编辑频率降低，编辑碱基减少，沿人类基因组的编辑位点在组间的分布显示出相当大的差异，特别是在编码角蛋白II型簇的12号染色体区域中；在先天性白内障和角膜异常的患者中发现位于15q25.1染色体区域的MIR184种子区域的c.57C>T突变[83]。此外有研究报道DOCK9[36]、CAST[84]、COL4A3、COL4A4[85]、RAD51[86]、IL1A、IL1B[52,87]、EPCAM、SHROOM3、SYNE1以及TEK[88]等基因可能与圆锥角膜的发生具有相关性，但其相应的致病位点及机制仍有待进一步研究。

4、总结与展望

迄今为止，基因治疗已被证明是一种治疗广泛遗传性视网膜变性的新型疗法[89],该疗法在视网膜疾病的成功研发，启发了人们对基因疗法在其他眼部疾病的思考，包括圆锥角膜。然而，由于圆锥角膜发病机制复杂，受多因素影响，仅在遗传领域就受多种基因序列影响，本文将与圆锥角膜相关的致病基因及其突变位点进行总结(表1),这些基因突变位点的鉴定可能是预测疾病严重程度和进展的重要生物标志物。虽然现有研究已发现大量与圆锥角膜相关的基因位点，但因样本数量限制、种族差异等因素而难以证明基因对圆锥角膜发病的遗传异质性[13],导致早期圆锥角膜的检测与诊断仍然面临着挑战，开发有效的圆锥角膜基因疗法无疑比单基因疾病更为复杂，因此进行基于人群的重复研究是有必要的。本文综述了与圆锥角膜相关的常见基因对其发病机制的作用，详细介绍了相应基因的突变位点，期望可以提高圆锥角膜防治的科学手段，及早预防圆锥角膜发展，促进针对圆锥角膜潜在基因治疗的发展，提高圆锥角膜患者预后。然而，目前所发现的候选基因谱并不全面，加之现有研究已证实的候选基因对圆锥角膜发病的影响尚存争议(例SOD1、VSX1、HGF),以及基因与其伴侣蛋白之间相互作用的致病性仍需进一步研究探索，因此，期望随着研究深入，挖掘与圆锥角膜发病机制和进展有关的其他重要遗传基因，以识别相关基因进行特异的候选搜索，实现检测相关基因表达情况以早期预判圆锥角膜的发生与进展，了解基因对圆锥角膜的作用机制，也为开发潜在的生物标志物和治疗干预靶点提供新思路。

表1 圆锥角膜相关致病基因及其突变位点总结

文章来源:刘才毓,杨芳文.基因在圆锥角膜发病机制中的影响[J].国际眼科杂志,2024,24(10):1588-1594.