角膜是重要的屈光介质,角膜保持完整和透明对视力非常重要。据报道估计2015年全世界约有3600万盲人,约有1000万人因角膜疾病而致盲,其中角膜缘干细胞缺乏症致盲是其主要原因之一[1,2]。目前对该疾病有效的治疗方法是角膜缘干细胞(limbalstemcells,LSCs)移植[3]。LSCs位于角膜和巩膜移行区,即角膜缘的Vogt栅栏区的上皮基底层[4],维持角膜上皮的正常稳态以及修复受损的角膜,当角膜上皮损伤时,LSCs会分裂产生子代瞬时扩增细胞(transientamplifyingcells,TAC),经过增殖、迁移和分化,以取代丢失的细胞[5]。同时正常的角膜缘及其干细胞也是防止结膜上皮细胞和血管侵入角膜的屏障[6,7]。当LSCs功能失调或不足时,就会发展为LSCD—患者致盲的原因之一[8],角膜移植是其治疗的一种手段,然而由于角膜资源不足、免疫排斥反应、免疫抑制剂的终生使用等诸多原因限制了角膜移植的应用,因此探索更多的治疗方法是研究者们共同的目标,而近年来LSCs移植逐渐成为研究的热点[9]。但目前并没有特异性的标志物可以鉴别LSCs。

1、LSCs标志物的确定标准

至今为止,还没有统一的标准来确定哪种分子或蛋白可以作为LSCs的标志物,Pajoohesh-Ganji等[10]研究认为标志物应满足几个条件:(1)要为LSCs的分离和扩增提供可靠的方法;(2)在健康人体中仍然能识别LSCs,并且携带标记物的LSCs数量保持相对稳定;(3)在LSCD患者中,表达这些标志物的LSCs减少。

2、LSCs标志物

近年关于LSCs标志物的研究很多,它们分类方式多样,且每种分类方式并不独立,互相辅助,可根据LSCs标志物的表达量分为阴性标志物和阳性标志物[11];也可以根据标志物在细胞的位置分为细胞质标志物如:角蛋白5、19(K5、K19)、α-烯醇化酶;核标记物如:p63及表面标志物包括整合素β1、α6、α9、ATP结合盒式转运蛋白2(ABCG2)等[12],有研究表明也可以具体分为细胞结构蛋白、细胞黏附因子、酶、细胞周期调节因子、生长因子及其受体、ATP结合盒式转运蛋白、分化相关标志物等[13]。

2.1阳性标志物

阳性标志物指那些相对于眼表其他部位仅在角膜缘呈现高表达的分子,包括角蛋白K5、K14、K19、波形蛋白(Vimentin)、细胞周期调节因子p63;C/EBPδ、Bmi-1、ABCG2、ATP结合盒式转运蛋白5(ABCB5);α-烯醇化酶;生长因子及其受体;整合素α2、β1、α6、α9;Notch-1、Importin13(IPO13)等。

2.1.1细胞结构蛋白

2.1.1.1角蛋白-K5和K14

K14属于Ⅰ型角蛋白家族的一个成员,是一种中间丝蛋白,主要表达于角膜缘上皮基底细胞。K5是Ⅱ型角蛋白,上皮细胞骨架的主要成分。通常,K14与K5形成二聚体,在细胞中共同表达,二者皆为LSCs阳性生物标志物[14]。然而,K5、K14作为角膜缘干细胞生物标记物也有局限性:首先K14的表达不限于角膜缘区域,在角膜中央也是阳性的;其次K5/K14在特定情况下可以作为LSCs的阳性标志物,有实验研究表明:在体外培养LSCs,2wk后应用气举技术(air-lifting)人工促进细胞分化,由于LSCs分化状态的动态变化,RTPCR(real-timePCR)和蛋白印记法(westernblotting)结果显示气举后K5mRNA和K14蛋白表达并没有减少,反而略有增加。这就提示K5和K14在LSCs未分化的阶段才被认为是LSCs的生物标志物,在积极进行分化的细胞中,其准确性降低[15]。故K5和K14只有在特定条件下被认为是LSCs阳性标志物,而且它们并不是特异性的表达于角膜缘,这些特点限制了K5和K14作为标志物的应用。

2.1.1.2K19和波形蛋白

K19是LSCs的阳性生物标志物,在角膜缘上皮基底细胞中表达[16],研究发现K19在结膜上皮和角膜上皮中均有表达[17]。K19和波形蛋白都属于中间细胞丝的成员,其中波形蛋白是中间丝中最丰富的蛋白质[18]。波形蛋白在角膜缘上皮基底细胞中表达,而它通常与其他生物标志物的表达结合在一起用于识别LSCs[15]。所以K19和波形蛋白都不是特异性的标志物。

2.1.2细胞周期调节因子

核蛋白p63是一种转录因子,在上皮的发育和再生中起着至关重要的作用,同时这种蛋白与肿瘤抑制和形态发生有关。同时作为p53家族成员,p63在细胞周期调控如细胞增殖和凋亡中起重要作用。p63在角膜缘上皮基底层表达,且在中央角膜上皮未发现表达[19]。DiIorio等[20]研究和分析培养LSCs,发现全克隆细胞可高表达p63,但在旁克隆细胞中未发现。p63表达6种蛋白亚型,根据是否有转录激活区(transactivation,TA)编码两组蛋白亚型TAp63(TAp63α,β和γ)和ΔNp63(ΔNp63α,β和γ),其中ΔNp63与LSCs的关系最密切,正常眼表的角化细胞可能含有所有的ΔN亚型:ΔNp63α,ΔNp63β,和ΔNp63γ,它们在角膜伤口愈合过程中表达,并与角膜缘细胞迁移、角膜再生和分化相关,而ΔNp63α位于角膜缘且不在角膜上皮细胞中表达[21]。无论LSCs是静息还是激活状态,ΔNp63都被认为是其标志物。在静息角膜缘,ΔNp63在基底层的小细胞簇中表达,在损伤愈合修复的过程中,ΔNp63在角膜缘基底细胞中的表达增加,这个过程似乎与C/EBPδ的失活有关[22]。并且当角膜损伤时,ΔNp63阳性细胞从角膜缘移向中央角膜。ΔNp63β和γ亚型在角膜和角膜缘的上基底层中对角膜损伤做出相应的反应,是一种分化程度更高的细胞类型[23]。另外,ΔNp63染色增强(可以称为ΔNp63-brightcells)与临床LSCs移植成功率有关,移植细胞中ΔNp63+细胞的含量少于3%时移植失败的概率提高[24]。综上所述可以认为ΔNp63是角膜缘干细胞的相对特异性生物标志物之一,而且在LSCs移植的过程中起着重要的作用。

2.1.3C/EBPδ和Bmi1

C/EBPδ是C/EBP家族的六个成员之一,在许多生物学过程中起转录因子的作用,包括细胞分化、运动、生长、停滞、增殖、细胞死亡、代谢和免疫反应,该蛋白功能多样性在一定程度上取决于细胞类型和细胞环境[25]。C/EBPδ能诱导LSCs有丝分裂的静止和自我更新,积极调节ΔNp63α的表达,维持干细胞的增殖潜能[26]。多梳基因Bmi1是PcG(polycombgroup)家族重要的调控基因,该基因与干细胞的增殖、自我更新和一系列肿瘤的发生、发展及预后密切相关,中枢神经系统、末梢神经系统和造血系统的干细胞都依赖该基因进行自我更新。另外,在小鼠精原干细胞中也检测到该基因的表达,该基因对精原干细胞的增殖也有一定的影响[27,28]。有丝分裂静止的LSCs共同表达C/EBPδ、Bmi1和ΔNp63,这些C/EBPδ+、Bmi1+和ΔNp63+细胞约占角膜缘上皮基底层的10%。角膜损伤后,LSCs被激活,C/EBPδ和Bmi1表达下调,这激活了ΔNp63+的干细胞增殖并迁移到中央角膜修复伤口。在这个过程中,最初的增殖期LSCs继续表达ΔNp63,但在终末分化时失去表达[29]。目前认为C/EBPδ、Bmi1可能是LSCs很有潜力的生物标志物,它们可以与ΔNp63共同标记LSCs,但更多发现有待进一步研究。

2.1.4ATP结合盒式转运蛋白

2.1.4.1ABCG2

ABCG2是ATP结合盒式(ATP-bindingcassette,ABC)转运蛋白家族的成员之一,是一种细胞表面蛋白,主要定位于质膜。基于Hoechst33342染料的细胞外排原理,ABCG2+细胞能被流式细胞计分离,骨髓和骨骼肌等许多组织的干细胞基于这种染料流出原理被分离出来,这种干细胞可定义为side-population(SP)细胞[30]。从角膜缘上皮分离的SP细胞用RT-PCR方法发现其表达ABCG2mRNA,因此ABCG2+细胞可以被认为是SP细胞的标记,但只有小部分角膜缘基底细胞表达SP细胞。ABCG2+细胞位于角膜缘上皮的基底层,也经常出现在角膜缘上皮的基底层,而在角膜上皮中则未发现表达。另外ABCG2的表达提高集落形成效率和生长能力[31]。因此根据以上研究提示这种转运蛋白ABCG2是LSCs一个阳性标记物,而且ABCG2在角膜组织中特异性的表达于角膜缘,但只有少量LSCs表达ABCG2,并不能作为独立的LSCs标志物。

2.1.4.2ABCB5

ABCB5是ABC转运蛋白家族另一成员,也是P-糖蛋白(P-gp)家族的成员,是一种能量依赖的药物外排转运体,因此ABCB5是肿瘤多药耐药性的机制之一[32]。另外ABCB5与肿瘤临床进展、治疗耐药性及复发有关[33,34]。根据以往的研究报道显示ABCB5最先被发现于皮肤恶性黑色素瘤[35],随着对它的深入研究发现ABCB5在多种肿瘤中都呈现高表达,如结肠直肠癌[36]、恶性血液病[37]、肝癌[38]、乳腺癌[39]等。近年来,ABCB5已被报道是LSCs发育和修复所必需的基因[40]。ABCB5在小鼠体内与溴脱氧尿苷标签保留的LSCs共表达,在人体内与ΔNp63α+LSCs共表达。无论是小鼠还是人类,ABCB5细胞均位于基底角膜缘上皮,在角膜上皮或结膜上皮中未发现该基因的表达。LSCD患者ABCB5呈阳性的LSCs的数量显著降低。另外在敲除ABCB5基因的小鼠体内因其功能的缺失会引起静止LSCs的耗尽,导致角膜分化不良和伤口愈合延迟,以上研究证明ABCB5不仅是LSCs的标记物,而且是LSCs功能所必需的基因,但目前为止并没有大量的实验研究证实这一结论,因此关于ABCB5的认识还需进一步的探索,这也为以后的研究提出了新的方向,让研究者们得到新的启发。

2.1.5细胞酶

α-烯醇化酶是烯醇化酶的一种同工酶,是原核和真核细胞胞浆中的关键糖酵解酶,是一种多功能蛋白,既是一种胞浆蛋白,也可以作为一种纤溶酶原结合受体在不同类型的细胞表面表达[41]。据报道,α-烯醇化酶最初免疫定位于角膜缘基底细胞[12],而且代谢增生越旺盛的干细胞表达的α-烯醇化酶越多,因此认为它可以作为LSCs的标志物。在角膜上皮清除术后上皮细胞从角膜缘基底细胞群迁移过程中,a-烯醇化酶的表达升高。近年来的研究证明,α-烯醇化酶不仅在角膜缘基底细胞中表达,也表达于基底上皮细胞[42]。另外有研究表明结膜上皮细胞也表达α-烯醇化酶,虽然α-烯醇化酶被认为是LSCs的标记物,但其特异性并不高。

2.1.6生长因子及其受体

生长因子及其受体包括上皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)、神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)、角质化细胞生长因子(keratinocytegrowthfactorreceptor,KGFR)等。它们是优先定位于角膜缘基底细胞的细胞膜上的蛋白质。据报道,大鼠角膜缘上皮中未分化的细胞与角膜基底上细胞含有较高水平的EGFR[12]。应用上皮生长因子受体抗体,人和大鼠角膜的角膜缘基底细胞均有较强的膜染色。然而从外周到角膜中央EGFR免疫染色强度下降[42]。另外EGFR在角膜缘基底细胞中有很强的表达,但其染色强度在角膜缘、角膜及结膜中并无明显差异[43]。在其他生长因子受体中,KGFR和NGF高亲和力受体也优先定位于角膜缘基底细胞。此类标记物众多,对于它们的认识仍需要更深入的分类研究。

2.1.7细胞黏附因子

细胞黏附因子包括整合素α2、α3、α4、α6、α8、α9、αv、β1、β4、β5、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、P-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白等。整合素是由α和β亚基组成的异二聚体I型跨膜蛋白,是参与控制疾病的发展并导致癌症和血栓形成等疾病的一种主要受体。整合素有18个α和8个β亚基,可以组装成24个不同的受体,具有不同的结合性质和组织分布[44,45]。整合素β1、β4、α2、α3、α6和αv主要表达于基底上皮细胞层;整合素α6和β4作为半粒体的组成成分,特异地定位于基底细胞的基底膜上[44]。整合素β1和α6被认为是表皮干细胞的标记物,整合素β1在角膜缘基底细胞的染色比上基底细胞强,而且对所有角膜上皮细胞均染色;整合素α6染色见于角膜缘上基底细胞和角膜上皮细胞,而未见于角膜缘基底细胞[42]。在发育中的小鼠眼表,整合素α9定位于表皮、结膜和角膜缘的基底细胞。在人角膜中,免疫染色和RT-PCR证实整合素α9的表达仅限于部分角膜缘基底上皮细胞,而且在对损伤反应细胞迁移过程中,整合素α9在角膜上皮细胞中的表达被激活[42]。但整合素α9和β1是否是LSCs的特异性细胞表面标记物还需要进一步研究。

2.1.8Notch-1和IPO13

Notch-1是一种跨膜受体,参与维持细胞的未分化状态,有报道认为其是LSCs的标志物。Notch-1存在于表达ABCG2的细胞亚群中,在Vogt的栅栏中与边缘基底细胞共域化,在静止细胞中高度表达[46],Thomas等[47]研究发现Notch-1的表达定位于少量的角膜缘上皮基底层细胞,且所有Notch-1阳性细胞共表达ABCG2。尽管所有Notch-1细胞ABCG2均为阳性,但并非所有ABCG2阳性细胞均表达Notch-1,因此证实Notch-1作为LSCs标记物具有良好的应用前景。

IPO13是核转运蛋白importinβ超家族新成员,是家族中唯一的双向转运受体蛋白,促进各种重要的细胞过程,其可以进行双向转运的底物包括:pax6、ubc9(ubiquitin-conjugatingenzyme9)、糖皮质激素受体、NF-YB/C二聚体等物质[48]。IPO13最初在胎鼠肺组织中发现,受激素和机体发育的双重调控,并在脑、肺和心脏的胚胎发育过程中起着重要的调控作用[49,50]。Wang等[51]研究发现IPO13主要在人角膜缘上皮的部分基底细胞的核内特异性高表达,在胞质内呈现弱表达,而且在角膜缘基底层、表层细胞以及中央角膜上皮细胞全层无表达,另外IPO13仅表达于角膜上皮祖细胞,在分化和成熟的角膜上皮细胞中不表达。因此可以推测IPO13将会成为LSCs有潜力、特异性高的标志物。

2.2阴性标志物

阴性标志物是指不表达或仅少量表达于角膜缘基底细胞的蛋白分子,其中包括分化相关标志物连接蛋白43(connexin43,Cx43)、角蛋白K3/12、外皮蛋白(involucrin)等,下面论述其主要标志物。

2.2.1Cx43

缝隙连接是由六种称为连接蛋白的跨膜蛋白组成的细胞-细胞连接,细胞间通过缝隙连接的内通道允许小分子量溶质在相邻细胞间直接被动扩散[52]。Cx43是缝隙连接蛋白家族的成员之一,免疫荧光染色检测Cx43在中央角膜上皮细胞和角膜缘上皮基底细胞中均有表达,而在角膜缘上皮基底细胞中未检测到Cx43的表达,并且完全没有Cx43表达的角膜缘基底细胞被认为是干细胞,然而那些对Cx43染色较弱的角膜缘基底细胞可能是祖细胞[53]。因此,Cx43可以被认为是人LSCs的一种阴性细胞表面标记物。

表1角膜缘干细胞标志物

表2角膜缘干细胞特点

2.2.2角蛋白K3/12

K3和K12是上皮细胞内中间丝的组成成分,是一种细胞骨架蛋白,使角膜上皮细胞结构更加稳固。有实验用单克隆抗体(AE5)检测发现角膜中央上皮中K3+基底细胞可能比角膜缘上皮K3-基底细胞具有更高的分化状态。另外,免疫组织化学也证明K3和K12在角膜上皮中识别出分化程度较高的细胞。从角膜缘向角膜基质迁移时,K3和K12角蛋白对的出现被解释为干细胞向TAC的分化[54]。角膜上皮细胞分化的标志物K3在角膜缘基底上皮细胞中不表达,K12是角膜特有的,除角膜缘基底细胞外,它存在于整个角膜上皮,因此K3和K12被广泛认为是在角膜上皮细胞、角膜缘上基底层细胞中特异性表达,而不在角膜缘基底细胞中表达[12]。这些研究证明K3和K12可以作为LSCs的阴性标志物,另外它们是细胞内蛋白,对LSCs的分离及培养等作用不大,所以目前还不是理想的标志物。

3、小结和展望

本文对主要LSCs标志物进行了归纳总结(表1、2):包括阳性标志物P63、角蛋白K5、K14、波形蛋白、ABCG2、α-烯醇化酶、整合素等,阴性标志物连接蛋白43、角蛋白K3、K12等,本文还介绍了最新研究的标志物ABCB5,它不仅可以标记LSCs,还可以起到修复作用,但对它的认识还需要更多的科学证明。角蛋白K5、K14、角蛋白K19和波形蛋白都属于中间丝蛋白,其中角蛋白K5、K14在特定情况下被认为是LSCs生物标记物,而角蛋白K19和波形蛋白并非特异性标志物,另外α-烯醇化酶、整合素的特异性也备受争议,p63是外胚层转录因子维持着细胞衰老和基因组稳定性,在角膜缘可特异性的检测到ΔNp63α的表达,然而它是细胞核即胞内标志物,自体移植LSCs时进一步的富集P63纯度是不可行的,这一特点限制了它的应用;ABCG2和ABCB5都是细胞表面运输蛋白,ABCG2负责Hoechst33342外排,但有研究表明只有小部分角膜缘基底细胞表达ABCG2。生长因子及其受体的种类众多且复杂,特异性也不高,因此作为LSCs标志物的应用并不高。目前虽然LSCs生物标志物的很多,但在应用中都有其自身的局限性,迄今为止,最有希望成为LSCs标志物的候选为C/EBPδ、Bmi1、ΔNp63、Notch-1,但这需要我们的进一步研究探索,而且随着科技的发展,基于mRNA或microRNA的生物标志物的开发以及先进技术的参与,对于LSCs的准确定位以及标记将会发生在不远的将来,这需要所有研究者的共同努力。LSCs作为一种重要干细胞来源,无论在科研还是在临床上均有着非常重要的意义,目前为止,国内外的研究学者对LSCs生物学标志物进行了大量的研究,并取得了重大进展,对LSCs的定位越来越精确而全面,体外扩增LSCs移植则显示了良好的应用前景,体外培养LSCs逐渐成为热门话题,在技术上,移植最主要的问题是没有特异性的标志物来识别LSCs,这将限制了该技术的发展,所以对LSCs标志物的确立有利于LSCs的分离和培养,对LSCD的治疗有着深远的意义。

徐丽娜,何宇茜,张妍,王淑荣.角膜缘干细胞标志物的研究进展[J].国际眼科杂志,2020,20(12):2064-2069.